使用ELISA檢測試劑盒繪制標準曲線時,線性不佳該排查哪些問題?
日期:2025-10-17 11:37:07
ELISA標準曲線線性不佳,需從試劑配制、加樣操作、孵育反應、檢測過程四個核心環節排查,這是定位問題的關鍵方向。
1、試劑配制環節:核心是確保標準品濃度準確
標準品濃度是繪制曲線的基礎,濃度不準會直接導致線性偏差。
檢查標準品復溶:確認是否嚴格按照說明書要求的溶劑(如特定稀釋液、蒸餾水)和體積復溶,復溶后是否充分混勻,避免局部濃度不均。
核查稀釋過程:排查梯度稀釋時是否出現“稀釋錯誤”,比如移液體積偏差、稀釋液用量錯誤,或未更換吸頭導致交叉污染。
確認試劑有效性:查看標準品、酶標抗體、底物等是否在有效期內,是否按要求儲存(如2-8℃冷藏或-20℃冷凍),反復凍融會導致試劑失效。

2、加樣操作環節:重點排查操作誤差
加樣過程的微小偏差會放大到標準曲線上,尤其影響低濃度或高濃度標準品的吸光度值。
檢查移液準確性:確認移液器是否校準,使用時是否按正確手法操作(如慢吸慢放),避免因操作過快產生氣泡或體積不準。
排查交叉污染:加樣時是否及時更換吸頭,尤其是在加完高濃度標準品后,未換吸頭會污染低濃度標準品,導致低濃度吸光度偏高。
確認加樣順序:是否按標準品濃度從低到高或從高到低順序加樣,無序加樣若伴隨吸頭污染,會增加誤差風險。
3、孵育反應環節:關鍵是保證反應條件一致
孵育條件不均會導致各孔反應程度不同,破壞曲線線性。
檢查孵育溫度:確認孵育箱實際溫度是否與說明書一致,是否存在箱內溫度不均(如靠近箱壁的孔溫度偏低),可使用溫度計實地測量。
核查孵育時間:是否嚴格遵循說明書的孵育時長,提前終止或延遲孵育會導致酶促反應不充分或過度,影響吸光度值。
確認反應板密封:孵育時是否加蓋板膜或放入濕盒,未密封會導致孔內液體蒸發,使試劑濃度升高,尤其高濃度標準品吸光度會異常偏高。
4、檢測過程環節:重點關注洗滌和底物反應
洗滌不徹底或底物反應異常,會干擾吸光度檢測結果,導致曲線線性差。
檢查洗滌步驟:確認洗滌液是否按要求稀釋,洗滌次數和浸泡時間是否符合說明書,洗滌不徹底會殘留未結合的酶標抗體,導致背景值升高;洗滌過度則會洗去特異性結合的復合物,導致吸光度偏低。
核查底物反應:確認底物是否在有效期內,是否按要求避光儲存,底物反應時間是否準確,反應終止液是否及時加入、體積是否一致,終止不及時會導致吸光度值偏高且不穩定。
檢查儀器狀態:確認酶標儀是否校準,檢測波長是否與說明書一致(如450nm為主波長,630nm為參比波長),儀器光源強度不足會導致檢測靈敏度下降,影響低濃度標準品的吸光度讀取。






