ELISA檢測中使用的酶標板在使用前是否需要進行預處理,具體步驟是什么?
日期:2025-09-28 09:40:44
在ELISA(酶聯免疫吸附試驗)檢測中,酶標板是否需要預處理,核心取決于板的類型,不同類型的酶標板處理要求差異顯著,具體可分為以下兩種情況及對應操作:
一、先明確酶標板類型:決定是否需要預處理
ELISA常用的酶標板主要分為“空白板(裸板)”和“預包被板(成品板)”兩類,二者的預處理需求完全不同:
預包被板(成品板):這類板在出廠前已完成抗原/抗體的包被、封閉及干燥處理,板孔內的特異性結合位點已穩定存在。因此,無需額外進行預處理,只需在使用前按照實驗說明書,用對應的洗滌液(如PBST)快速平衡1-2次,去除板孔內可能殘留的微量雜質或潮氣,即可直接加入樣本進行后續反應,避免預處理破壞已包被的分子結構。
空白板(裸板):這類板僅為聚苯乙烯材質的空板,板孔表面無任何特異性結合分子,且活性基團較少,直接用于包被會導致抗原/抗體吸附效率低、結合不牢固,還可能產生高背景信號。因此,必須進行預處理,核心目的是激活板孔表面活性、實現特異性分子包被并封閉非特異性位點,具體步驟如下:

二、空白板(裸板)的預處理核心步驟
1.板孔表面清潔(可選,視板的潔凈度而定)
若空白板開封后暴露在空氣中較久,或肉眼可見板孔內有輕微粉塵,需先進行清潔:用無酶純水或PBST(含0.05%Tween-20的PBS)緩慢沖洗每個板孔1-2次,沖洗時避免液體飛濺導致交叉污染;沖洗后將板倒扣在干凈的吸水紙上(吸水紙需提前滅菌或確保無雜質),輕輕按壓瀝干板孔內殘留液體,不可用吹風機吹干(高溫或氣流可能破壞板孔表面結構)。
2.特異性分子包被(核心步驟)
配置包被液:根據待包被的抗原/抗體特性,選擇合適的包被緩沖液(常用0.05M碳酸鹽緩沖液,pH9.6;或0.01MPBS,pH7.4),將抗原/抗體稀釋至實驗所需濃度(通常為1-10μg/mL,具體濃度需通過預實驗優化),確保稀釋過程中無沉淀、混合均勻。
加樣包被:用移液器將配置好的包被液精準加入每個板孔,每孔加樣量通常為100-200μL(需覆蓋板孔底部,避免出現氣泡);加樣后用封板膜密封酶標板,防止液體蒸發或污染。
孵育包被:將密封好的酶標板置于適宜條件下孵育,常用條件為4℃冰箱過夜孵育(12-16小時,利于分子緩慢均勻吸附),或37℃恒溫孵育1-2小時(快速包被,適用于時間緊張的實驗);孵育過程中避免酶標板傾斜,防止液體聚集在板孔邊緣導致吸附不均。
3.洗板(去除未結合的包被分子)
包被孵育結束后,需去除板孔內未吸附的游離抗原/抗體,避免干擾后續反應:
棄去板孔內的包被液,將板倒扣在吸水紙上輕輕拍干(不可用力擠壓,防止損傷板孔表面);
向每個板孔加入200-300μL洗滌液(常用PBST),浸泡1-2分鐘后棄去洗滌液,重復該操作3-5次(每次浸泡時間需一致,確保洗滌充分);
最后一次洗滌后,將板倒扣在吸水紙上徹底拍干,避免板孔內殘留洗滌液影響后續封閉效果。
4.封閉(降低非特異性結合,關鍵步驟)
板孔表面除了吸附特異性包被分子外,仍存在大量未結合的聚苯乙烯位點,這些位點可能非特異性結合后續反應中的抗體、酶標記物等,導致背景信號升高。因此需進行封閉:
配置封閉液:選擇合適的封閉劑(常用5%脫脂奶粉-PBST、1%BSA-PBST,若檢測體系中存在牛奶蛋白干擾,可選用0.5%明膠-PBST),封閉液需現配現用,避免反復凍融。
加樣封閉:向每個板孔加入150-200μL封閉液,確保完全覆蓋板孔底部;用封板膜密封后,置于37℃恒溫孵育30分鐘至1小時(或4℃孵育過夜,封閉更充分)。
二次洗板:封閉結束后,棄去封閉液,按上述“洗板”步驟用PBST洗滌3-5次,最后徹底拍干;此時預處理完成,酶標板可立即用于后續的樣本孵育、抗體結合等ELISA步驟,若暫不使用,可將板密封后置于4℃冰箱保存(保存時間不超過24小時,避免封閉效果下降)。
三、預處理關鍵注意事項
所有試劑(包被液、封閉液、洗滌液)需提前平衡至室溫(尤其是4℃保存的試劑),避免溫度波動導致板孔內分子吸附不均;
加樣時移液器槍頭需一次性使用,避免交叉污染;
孵育時間和溫度需嚴格遵循實驗方案,不可隨意更改(如延長包被時間可能導致分子聚集,縮短封閉時間可能導致背景升高);
洗板步驟需規范,確保每次洗滌充分且拍干徹底,殘留液體是導致實驗重復性差的常見原因之一。






