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如何判斷ELISA檢測結果是否有效,是否存在假陽性或假陰性的情況,原因是什么?

日期:2025-09-26 14:15:38

    在ELISA(酶聯免疫吸附試驗)檢測中,判斷結果有效性的核心是對照體系的合理性與信號值的邏輯一致性,而假陽性、假陰性的產生則與試劑質量、操作流程、樣本特性等多維度因素相關。需通過“結果有效性判斷標準”“假陽性/假陰性的識別與成因”兩方面系統分析:
 
一、ELISA檢測結果有效性的判斷標準
    ELISA結果是否有效,首要依賴內置對照的正常表現(所有對照需同時滿足預期,缺一不可),其次結合檢測樣本的信號值邏輯(如是否符合濃度梯度規律),具體判斷依據如下:
 
1.核心對照體系必須全部達標
    ELISA實驗設計中,對照的作用是驗證“試劑活性”“操作流程”“反應環境”是否正常,所有對照需同時滿足預設標準,否則結果無效,常見對照及達標要求如下:
 
    空白對照(BlankControl):僅加酶標試劑、底物溶液,不加任何樣本和抗體(或僅加稀釋液),用于檢測“試劑本底信號”(如酶標二抗的非特異性結合、底物自發顯色)。
    達標要求:空白對照的OD值(吸光度值)需≤說明書規定的上限(通常≤0.1或0.05,具體以試劑說明書為準)。若空白OD值過高,說明試劑存在污染(如酶標二抗變質)或操作中引入雜質,會導致所有樣本信號偏高,結果不可靠。
    陰性對照(NegativeControl,NC):已知不含目標抗原/抗體的樣本(如健康人血清、陰性標準品),用于驗證“非特異性結合的基線”。
    達標要求:陰性對照的OD值需≤“cut-off值”(判斷陽性/陰性的臨界值,通常由試劑說明書給出,如陰性對照OD值+2倍標準差,或固定值),且需顯著低于陽性對照。若陰性對照OD值接近或超過cut-off值,說明存在非特異性結合干擾,可能導致假陽性。
    陽性對照(PositiveControl,PC):已知含目標抗原/抗體的標準品(濃度明確),用于驗證“試劑的檢測活性”(如包被抗體的結合能力、酶標試劑的催化活性)。
    達標要求:陽性對照的OD值需≥說明書規定的下限(通常≥0.8或1.0,且需遠高于cut-off值),且需符合“濃度-信號正相關”(如梯度稀釋的陽性標準品,OD值隨濃度降低而遞減)。若陽性對照OD值過低(接近cut-off值)或無信號,說明試劑失效(如包被抗體變性、酶標二抗失活)或反應條件異常(如孵育溫度不足、底物過期),所有樣本結果均無效。
    標準品對照(StandardControl,僅定量ELISA需關注):一系列已知濃度的目標抗原/抗體(如0、10、50、200pg/mL),用于繪制標準曲線。
    達標要求:標準曲線的相關系數(R²)需≥0.98(線性回歸)或0.99(四參數回歸),且每個標準品的OD值需在預設范圍內(如最高濃度標準品OD值≥1.5,最低濃度標準品OD值需高于空白對照3倍以上)。若標準曲線線性差(R²<0.98),說明標準品稀釋不準確或反應重復性差,無法準確定量樣本濃度。
 
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2.樣本信號值需符合邏輯規律
    在對照達標的前提下,樣本結果需滿足“信號值與檢測目的一致”:
    定性ELISA:樣本OD值>cut-off值判定為陽性,<cut-off值判定為陰性,接近cut-off值(如cut-off值±10%)需重復檢測確認;
    定量ELISA:樣本OD值需落在標準曲線的“線性范圍內”(不可超出最高標準品濃度或低于最低標準品濃度),超出范圍需稀釋樣本后重新檢測(超出上限會導致信號飽和,結果偏低;低于下限則定量不準確)。
 
二、ELISA假陽性的識別與成因
    假陽性指“實際不含目標抗原/抗體的樣本,檢測結果判定為陽性”,可通過“陰性對照異常”或“重復檢測結果不一致”識別,核心成因包括以下4類:
1.非特異性結合導致的干擾
    這是最常見的假陽性原因,指檢測體系中無關分子與抗體(包被抗體或酶標二抗)發生非特異性結合,產生虛假信號:
 
    樣本自身的干擾物質:如血清樣本中的異嗜性抗體(人體天然存在的、可結合動物IgG的抗體,如類風濕因子)、高濃度的蛋白質(如白蛋白、免疫球蛋白)或脂質,會與酶標二抗(通常為鼠源、兔源IgG)結合,導致OD值升高;
    抗體交叉反應:包被抗體或酶標二抗的特異性不足,與樣本中結構類似的“同源分子”結合(如檢測流感病毒A的抗體,與流感病毒B的某一抗原表位交叉結合);
    試劑污染:酶標二抗中混入了與樣本無關的抗體,或底物溶液被酶(如辣根過氧化物酶HRP)污染,導致非特異性顯色。
 
2.操作流程不規范
    孵育條件異常:如孵育溫度過高(超過37℃)或時間過長(如說明書要求30分鐘,實際孵育60分鐘),會增加抗體與無關分子的非特異性結合;
    洗滌不充分:ELISA每一步反應后需用洗滌液(如含吐溫20的PBS)沖洗反應孔,去除未結合的抗體/樣本。若洗滌次數不足、洗滌液用量不夠或未甩干殘留液體,未結合的酶標二抗會殘留于孔中,導致顯色偏深;
    樣本交叉污染:加樣時槍頭混用、反應孔液體溢出,導致陽性樣本的抗原污染陰性樣本,出現假陽性。
 
3.試劑質量問題
    包被抗體純度低:包被在酶標板上的抗體含雜蛋白,或未封閉的酶標板孔壁(未用BSA、酪蛋白封閉)暴露,導致樣本中無關分子吸附在孔壁,產生背景信號;
    酶標二抗活性過高或非特異性強:酶標二抗的標記效率過高,或未去除針對樣本中其他成分的抗體,易與無關分子結合。
 
三、ELISA假陰性的識別與成因
    假陰性指“實際含目標抗原/抗體的樣本,檢測結果判定為陰性”,可通過“陽性對照正常但樣本無信號”或“已知陽性樣本檢測為陰性”識別,核心成因包括以下4類:
 
1.樣本處理不當導致目標分子失活或損失
    樣本采集/儲存錯誤:如檢測血清中的抗原,卻使用了溶血樣本(紅細胞破裂釋放的血紅蛋白會抑制酶活性,導致顯色減弱);樣本長期室溫放置(目標抗原降解,如RNA病毒、不穩定蛋白)或反復凍融(抗原變性);
    樣本稀釋錯誤:樣本濃度過高卻未稀釋,導致“鉤狀效應”(高濃度抗原與包被抗體的兩個結合位點同時結合,形成“抗原-抗體”復合物,無法再結合酶標二抗,反而使信號值降低,甚至低于cut-off值);或稀釋倍數過高,導致抗原濃度低于檢測下限;
    提取過程失誤:如從組織、細胞中提取抗原時,使用的裂解液過于劇烈(如高濃度變性劑),導致抗原變性,無法與抗體結合。
 
2.試劑失效或反應條件不足
    關鍵試劑過期:如包被抗體變性(失去結合抗原的能力)、酶標二抗的酶活性喪失(如HRP失活)、底物溶液過期(如TMB底物氧化失效,無法顯色);
    反應條件不足:如孵育溫度過低(如低于25℃)或時間過短(如說明書要求60分鐘,實際僅孵育15分鐘),導致抗體與抗原的結合不充分;底物反應時間不足(如說明書要求15分鐘,實際僅5分鐘),顯色未達到檢測閾值。
 
3.抗體特異性過強或表位遮蔽
    抗體識別的表位被修飾:如檢測的抗原在樣本中存在翻譯后修飾(如磷酸化、糖基化),而包被抗體識別的是“未修飾表位”,導致無法結合;
    樣本中存在“封閉因子”:如樣本中的游離抗原片段、藥物分子(如針對目標抗原的治療抗體),會先與樣本中的目標抗原結合,遮蔽抗體識別的表位,導致抗體無法結合抗原。
 
四、減少假陽性/假陰性的關鍵措施
    嚴格遵循試劑說明書:包括樣本處理方法、孵育溫度/時間、洗滌次數、試劑稀釋比例,不隨意調整操作步驟;
    設置足夠的對照:除基礎的空白、陰/陽性對照外,可增設“樣本對照”(樣本+稀釋液,無抗體)排除樣本自身顯色干擾;
    重復驗證可疑結果:對接近cut-off值的樣本、與臨床診斷不符的結果,需用同一試劑重復檢測,或換用不同廠家的試劑交叉驗證;
    優化樣本處理:如血清樣本離心去除脂質、溶血成分;高濃度樣本按梯度稀釋,避免鉤狀效應;使用無酶污染的耗材處理樣本。
 
    異性結合不足”或“目標分子無法有效結合”,需從試劑質量、操作規范、樣本特性三方面綜合控制,才能確保檢測結果可靠。