血清樣本采集后需經過哪些處理步驟才能用于ELISA檢測?
日期:2025-08-21 15:29:48
血清樣本采集后,需經過一系列標準化處理以去除雜質、避免降解,并確保樣本狀態符合ELISA檢測要求,具體步驟如下:
一、樣本采集后的即時處理(關鍵步驟,影響樣本穩定性)
1、血液凝固與血清分離
采集全血后,將血液注入無抗凝劑的離心管(如普通血清管),室溫(20-25℃)靜置30-60分鐘,待血液自然凝固(避免劇烈震蕩,防止溶血)。
凝固后,以3000-4000rpm離心10-15分鐘(離心半徑需匹配離心機參數),使血清與血塊分離。離心后上清液即為血清(淡黃色透明液體),下層為紅細胞、白細胞及凝血塊。
2、血清轉移與初步分裝
用移液器小心吸取上層血清(避免觸及下層血細胞或血塊,防止溶血或污染),轉移至新的無菌離心管中。
若樣本暫不檢測,需立即分裝(如每管50-100μL),避免反復凍融導致蛋白降解(反復凍融會破壞蛋白質結構,影響ELISA檢測的抗原 - 抗體結合)。
二、溶血與脂血樣本的處理(排除干擾因素)
溶血樣本:若血清因紅細胞破裂呈現紅色(血紅蛋白釋放),需評估是否影響檢測 —— 血紅蛋白可能干擾酶促反應或產生非特異性結合。輕度溶血可嘗試使用,但嚴重溶血建議重新采集樣本。
脂血樣本:血清因高脂含量呈現渾濁或乳白色時,需3000rpm離心15分鐘去除部分脂類,或使用商用去脂試劑處理(避免脂類顆粒影響吸光度讀數)。
三、樣本的儲存(防止蛋白降解)
短期儲存(1-3 天):2-8℃冷藏(如冰箱冷藏室),但需避免反復拿出導致溫度波動。
長期儲存:-20℃或-80℃冷凍(-80℃更適合長期保存,可減少蛋白降解)。注意:樣本需完全凍存后再放入冰箱,避免溫度梯度導致的蛋白變性;標注樣本信息(編號、采集日期、凍存次數)。
四、檢測前的樣本準備
1、凍存樣本的解凍
從冰箱取出后,置于室溫自然解凍(或4℃緩慢解凍),避免37℃水浴快速解凍(高溫會導致蛋白變性)。
解凍后輕輕顛倒離心管混勻(避免劇烈震蕩產生氣泡),必要時以1000-2000rpm 離心5分鐘,去除可能的沉淀或雜質。
2、樣本稀釋(根據ELISA試劑盒要求)
多數ELISA試劑盒需要對血清樣本進行稀釋(如 1:10、1:100),以確保檢測信號在試劑盒的線性范圍內(避免濃度過高導致的 “鉤狀效應”)。
稀釋需使用試劑盒配套的稀釋液(或PBS等緩沖液),嚴格按照說明書的比例操作,避免自行調整稀釋倍數。
3、排除樣本中的顆粒物
若樣本解凍后出現沉淀或渾濁,需再次離心(3000rpm,5-10分鐘),取上清用于檢測,防止顆粒物堵塞ELISA板孔或干擾顯色。
五、注意事項
無菌操作:全程使用無菌耗材(離心管、移液器槍頭),避免樣本污染(細菌或真菌污染會降解蛋白,導致假陰性)。
避免反復凍融:分裝樣本時按單次檢測用量分裝,每支樣本凍融次數不超過3次。
匹配試劑盒要求:部分ELISA試劑盒對樣本處理有特殊要求(如需去除特定蛋白、調整pH值),需嚴格遵循試劑盒說明書(例如,檢測某些細胞因子時,血清需避免溶血,因紅細胞會釋放干擾因子)。
通過以上步驟,可確保血清樣本中的目標蛋白(抗原或抗體)保持穩定且無干擾,為ELISA檢測提供可靠的樣本基礎,減少實驗誤差。






