重組蛋白用于動物實驗或細(xì)胞實驗前，需要去除內(nèi)毒素，常用的內(nèi)毒素去除方法（如親和層析、超濾）的效果該如何通過鱟試劑法驗證？
日期：2025-09-28 09:31:21
重組蛋白用于動物或細(xì)胞實驗前，內(nèi)毒素殘留需嚴(yán)格控制（如細(xì)胞實驗通常要求＜0.1EU/μg，動物實驗＜1EU/μg），鱟試劑法是國際公認(rèn)的內(nèi)毒素檢測金標(biāo)準(zhǔn)，可精準(zhǔn)驗證親和層析、超濾等去內(nèi)毒素方法的效果。其核心原理是利用鱟（馬蹄蟹）血液提取物中的凝固蛋白原系統(tǒng)與內(nèi)毒素（脂多糖，LPS）特異性反應(yīng)，通過觀察“凝固狀態(tài)”或“信號強度”定性或定量判斷殘留量，具體驗證流程需結(jié)合方法類型和樣品特性展開。
一、鱟試劑法的核心類型（按需選擇）
鱟試劑法主要分為凝膠法和光度法，二者原理一致但檢測精度和適用場景不同，需根據(jù)實驗對“內(nèi)毒素控制精度”選擇：
凝膠法：內(nèi)毒素激活鱟試劑中的凝固酶原，使凝固蛋白原轉(zhuǎn)化為凝固蛋白，形成不溶性凝膠。該方法操作簡單、成本低、特異性強，適合定性判斷（內(nèi)毒素是否超標(biāo)）或半定量估算（確定大致殘留范圍），常用于去內(nèi)毒素后的快速初篩。
光度法：內(nèi)毒素激活反應(yīng)產(chǎn)生的凝固酶會水解特定底物，釋放發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán)，通過檢測吸光度或熒光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，實現(xiàn)內(nèi)毒素的精確定量。該方法精度高（檢測限可達(dá)0.001EU/mL），能準(zhǔn)確量化親和層析、超濾前后的內(nèi)毒素殘留變化，適合評估去內(nèi)毒素方法的效率。
二、驗證的核心前提：樣品預(yù)處理（消除干擾）
親和層析、超濾后的重組蛋白樣品常含緩沖液成分（如Tris、NaCl、EDTA、咪唑），這些物質(zhì)可能抑制或激活鱟試劑反應(yīng)，導(dǎo)致“假陰性”或“假陽性”，因此檢測前必須進(jìn)行預(yù)處理，核心是排除干擾：
稀釋處理：用“無熱原稀釋液”（如無菌無熱原水、0.1%BSA無熱原溶液）將蛋白樣品稀釋至合適濃度——稀釋倍數(shù)需結(jié)合蛋白濃度（避免高濃度蛋白本身干擾）和內(nèi)毒素預(yù)期殘留量（確保殘留量落在檢測范圍內(nèi)，如凝膠法通常檢測范圍0.03-10EU/mL），一般稀釋10-100倍。
干擾試驗（必需步驟）：取稀釋后的蛋白樣品，分為兩組：①樣品組（僅稀釋后的蛋白）；②樣品加標(biāo)組（稀釋后的蛋白+已知濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，如0.5EU/mL）。同時設(shè)置“陰性對照”（僅無熱原稀釋液）和“陽性對照”（無熱原稀釋液+同等濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品）。若樣品加標(biāo)組的檢測結(jié)果與陽性對照的偏差在±50%以內(nèi)，說明樣品無干擾，可直接檢測；若偏差過大，需進(jìn)一步稀釋、透析去除干擾物質(zhì)（如EDTA、高鹽）或更換緩沖液。
三、具體驗證流程（分方法詳解）
1.凝膠法驗證（定性/半定量）
適用于初步判斷“去內(nèi)毒素后的蛋白是否達(dá)標(biāo)”，無需特殊儀器，操作步驟如下：
試劑準(zhǔn)備：取鱟試劑（干粉），按說明書比例用無熱原稀釋液復(fù)溶（如1支0.1mL規(guī)格的試劑加0.1mL稀釋液），輕輕混勻避免氣泡。
加樣反應(yīng)：在無熱原試管中加入0.1mL復(fù)溶后的鱟試劑，再加入0.1mL預(yù)處理后的蛋白樣品（樣品組）、樣品加標(biāo)組、陰性對照、陽性對照，輕輕混勻后，垂直放入37℃±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中，避光靜置60分鐘±2分鐘，期間避免震動。
結(jié)果判斷：
定性判斷：培養(yǎng)結(jié)束后，輕輕取出試管并倒置180°，若試管內(nèi)形成“完整、堅韌的凝膠柱”且不脫落，為陽性（含內(nèi)毒素）；若凝膠未形成或破碎，為陰性（無內(nèi)毒素或低于檢測限）。
半定量估算：若樣品陽性，可將樣品進(jìn)一步梯度稀釋（如2倍、4倍、8倍），重復(fù)檢測，以“最后呈陽性的最高稀釋倍數(shù)”結(jié)合稀釋因子計算內(nèi)毒素含量（如稀釋8倍仍陽性，檢測限0.03EU/mL，則樣品內(nèi)毒素≥0.03×8=0.24EU/mL）。
驗證結(jié)論：若樣品組呈陰性，說明內(nèi)毒素殘留低于檢測限，去內(nèi)毒素方法有效；若陽性，需結(jié)合半定量結(jié)果判斷是否超標(biāo)，若超標(biāo)則需優(yōu)化去內(nèi)毒素方案。
2.光度法驗證（精確定量）
適用于準(zhǔn)確評估親和層析、超濾的去內(nèi)毒素效率（如計算“去內(nèi)毒素前后的內(nèi)毒素去除率”），需配套酶標(biāo)儀或?qū)Ｓ明c試劑檢測儀，步驟如下：
標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品用無熱原稀釋液梯度稀釋成一系列濃度（如0.001、0.01、0.1、1、10EU/mL），取各濃度標(biāo)準(zhǔn)品0.1mL，分別與0.1mL復(fù)溶的光度法鱟試劑混合，按說明書反應(yīng)條件（如37℃孵育30分鐘）進(jìn)行反應(yīng)，檢測各濃度對應(yīng)的吸光度或熒光值，以“內(nèi)毒素濃度為橫坐標(biāo)，信號值為縱坐標(biāo)”繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（需保證R²≥0.98）。
樣品檢測：取0.1mL預(yù)處理后的蛋白樣品，與0.1mL鱟試劑混合，同標(biāo)準(zhǔn)曲線條件反應(yīng)并檢測信號值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的內(nèi)毒素濃度。
結(jié)果校正與計算：結(jié)合樣品的稀釋倍數(shù)，計算“蛋白樣品中內(nèi)毒素的實際含量”（如稀釋10倍后檢測濃度為0.005EU/mL，則實際含量=0.005×10=0.05EU/mL）；再根據(jù)蛋白濃度換算成“EU/μg”（如蛋白濃度1mg/mL=1000μg/mL，則內(nèi)毒素含量=0.05EU/mL÷1000μg/mL=0.00005EU/μg），與實驗要求的限值對比。
驗證結(jié)論：若計算結(jié)果低于實驗限值（如細(xì)胞實驗＜0.1EU/μg），且去內(nèi)毒素前后的殘留量差異顯著（如去除前10EU/μg，去除后0.05EU/μg，去除率達(dá)99.5%），說明方法有效；若未達(dá)標(biāo)，則需分析去內(nèi)毒素步驟的缺陷（如親和層析的LPS吸附柱飽和、超濾膜孔徑選擇不當(dāng)）并優(yōu)化。
四、關(guān)鍵注意事項
全程無熱原操作：所有耗材（試管、移液槍頭、離心管）需為“無熱原級別”，操作在超凈工作臺進(jìn)行，避免環(huán)境中內(nèi)毒素污染（如手部接觸、空氣揚塵），否則會導(dǎo)致假陽性。
試劑有效性控制：鱟試劑需在2-8℃避光儲存，復(fù)溶后立即使用；內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品需分裝凍存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致活性下降。
對照設(shè)置不可少：陰性對照用于排除稀釋液、耗材的內(nèi)毒素污染，陽性對照用于驗證鱟試劑的活性，樣品加標(biāo)組用于確認(rèn)樣品無干擾，缺任一對照都會導(dǎo)致結(jié)果不可靠。
用鱟試劑法驗證去內(nèi)毒素效果的核心邏輯是：先通過預(yù)處理消除樣品干擾，再根據(jù)精度需求選擇凝膠法（初篩）或光度法（定量），結(jié)合對照和標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷殘留量，最終確認(rèn)親和層析、超濾等方法是否達(dá)到實驗要求的內(nèi)毒素控制標(biāo)準(zhǔn)。
