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流式抗體常見的熒光素標記(如FITC、PE、APC、PerCP-Cy5.5)各有什么光譜特性,如何避免不同熒光素之間的光譜重疊干擾?

日期:2025-09-08 13:57:16

    在流式細胞術(FCM)中,熒光素的光譜特性直接決定了檢測通道的選擇和實驗結果的準確性。以下將先系統梳理FITC、PE、APC、PerCP-Cy5.5四種常用熒光素的核心光譜特性,再詳細說明避免光譜重疊干擾的關鍵策略。

一、四種常用熒光素的核心光譜特性
    流式抗體的熒光素選擇需匹配流式細胞儀的激發光(激光器) 和發射光檢測器(濾光片) ,其核心參數包括激發波長(Ex)、最大發射波長(Em)及適用的檢測通道。以下表格對比了四種熒光素的關鍵特性:
 
熒光素 核心成分
/類型
激發波長
(Ex)
最大
發射
波長
(Em)
適用激發光源 常用檢測通道 關鍵優勢 潛在局限
FITC 熒光素異硫氰酸酯 488nm 525nm 488nm氬離子激光器 綠色通道(525±15nm) 經典熒光素,成本低、穩定性好;與多數流式儀兼容 量子產率較低(信號偏弱);易受自發熒光干擾
PE 藻紅蛋白(藻膽蛋白) 488nm
/561nm
578nm 488nm氬離子激光器、561nm黃激光 橙紅色通道(585±20nm) 量子產率極高(信號強,適合弱表達抗原);亮度是 FITC的5-10倍 易發生光漂白(需避光保存/使用);分子量較大(可能影響抗體結合活性)
APC 別藻藍蛋白(藻膽蛋白) 633nm
/635nm
660nm 633nm氦氖激光器、635 nm 紅激光 遠紅通道(660±10nm) 激發波長遠離可見光區,自發熒光干擾極小;信號穩定 需匹配 633/635nm 激光器(部分基礎流式儀無此光源)
PerCP-Cy5.5 藻青蛋白 (PerCP) 與 Cy5.5 偶聯 488nm 695nm 488nm氬離子激光器 深紅通道(695±20nm) 可與488nm 激發的FITC/PE共用光源,且發射波長遠離二者(減少重疊) 量子產率較低(信號偏弱,不適合弱表達抗原);易出現 “補償溢出”(需精準調節補償)
 
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二、如何避免熒光素之間的光譜重疊干擾
    熒光素的發射光譜重疊是流式實驗中最常見的干擾來源(如FITC的發射光譜尾部會延伸至 PE 的檢測通道),若不處理會導致 “假陽性信號” 或數據失真。核心解決思路是 “合理設計熒光素組合”+“精準校正儀器補償”,具體策略如下:
 
1. 優先選擇 “光譜分離度高” 的熒光素組合
    這是從源頭減少重疊的關鍵,需遵循兩個原則:
 
    激發波長差異大:若條件允許,盡量將熒光素分配到不同激發光通道。例如:
        488nm通道:標記FITC(綠色)、PE(橙紅);
        633 nm 通道:標記 APC(遠紅);
        避免將所有熒光素都集中在同一激發通道(如 488 nm),減少該通道內的發射光譜重疊。
    發射波長間隔≥30nm:選擇最大發射波長(Em)差距較大的熒光素。例如:
        推薦組合:FITC(525 nm)+ PE(578 nm)+APC(660nm)(發射波長依次相差 53 nm、82 nm,重疊少);
        避免組合:FITC(525 nm)+ Alexa Fluor 488(519nm)(發射波長僅差 6 nm,重疊嚴重)。
 
2. 精準調節 “熒光補償(Fluorescence Compensation)”
    即使選擇了分離度高的組合,仍會存在輕微光譜重疊(如 PE 的發射光會少量進入 APC通道),需通過儀器補償消除:
 
    補償原理:用 “單陽性對照管”(僅標記一種熒光素的細胞)測定 “溢出信號比例”,再通過儀器算法從目標通道中扣除溢出的干擾信號。
    操作步驟:
        準備未染色對照管(排除細胞自發熒光)、單陽性對照管(每種熒光素各 1 管,如僅 FITC 陽性、僅 PE 陽性);
        先檢測未染色對照,設定 “陰性信號基線”;
        依次檢測單陽性對照,儀器自動計算 “溢出系數”(如 PE 信號進入 FITC 通道的比例);
        應用補償系數后,確保單陽性細胞僅在 “目標通道” 顯示陽性,其他通道無假陽性。
    注意:補償需針對 “特定儀器、特定熒光素批次” 重新調節,不可直接套用其他實驗的補償參數。
 
3. 結合 “熒光素亮度” 匹配抗原表達水平
    熒光素的亮度差異(PE > FITC > APC > PerCP-Cy5.5)會間接影響信號區分度,需結合抗原表達量選擇:
 
    強表達抗原:可選擇亮度較弱的熒光素(如 FITC、PerCP-Cy5.5),即使有輕微重疊,強信號也易與背景區分;
    弱表達抗原:必須選擇亮度極高的熒光素(如 PE),避免弱信號被重疊干擾掩蓋;
    禁忌:不可將弱亮度熒光素(如 PerCP-Cy5.5)用于弱表達抗原,否則信號易被重疊干擾 “吞噬”,導致數據無效。
 
4. 利用 “儀器硬件升級” 減少重疊
    若實驗需同時檢測多種熒光素(如4色及以上),可通過儀器配置優化:
 
    多激光器配置:選擇配備 488nm、561nm、633nm、405nm(紫外)的流式儀,將熒光素分配到不同激發通道(如 405nm 激發 Pacific Blue,與 488nm通道的FITC完全無重疊);
    窄帶濾光片:更換 “窄帶寬發射濾光片”(如將FITC的525±15nm濾光片換成 525±10nm),減少相鄰熒光素的光譜重疊范圍(如降低FITC對PE通道的干擾)。
 
    避免熒光素光譜重疊的核心邏輯是 “前期合理設計(組合+亮度匹配)+ 中期精準補償(單陽對照+儀器校正)+ 后期硬件優化”。實際實驗中,需先根據現有儀器的激光器 / 濾光片配置,選擇 “激發分離、發射間隔大” 的熒光素組合(如FITC+PE+APC是經典的低重疊3色組合),再通過單陽性對照嚴格校正補償,最后結合抗原表達量匹配熒光素亮度,即可最大程度降低干擾,獲得可靠的流式數據。