樣本中存在干擾物質(zhì)時(shí)，ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性，如何通過(guò)試劑盒設(shè)計(jì)或樣本預(yù)處理消除此類(lèi)干擾？
日期：2025-11-24 14:20:20
當(dāng)ELISA檢測(cè)中存在異嗜性抗體（HAMA）、類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）等干擾物質(zhì)時(shí)，假陽(yáng)性的核心成因是干擾物質(zhì)與試劑盒中的抗體（捕獲/檢測(cè)抗體、酶標(biāo)二抗）發(fā)生非特異性結(jié)合（如RF可同時(shí)結(jié)合抗體的Fc段，HAMA可跨物種結(jié)合鼠源/兔源抗體）。解決思路需從試劑盒設(shè)計(jì)優(yōu)化（主動(dòng)阻斷干擾）和樣本預(yù)處理（提前去除干擾物）兩方面入手，以下是具體技術(shù)方案及原理：
一、試劑盒設(shè)計(jì)層面：加入阻斷劑或優(yōu)化抗體/反應(yīng)體系
試劑盒設(shè)計(jì)是從源頭減少干擾的核心，通過(guò)在試劑中添加特異性阻斷劑、優(yōu)化抗體類(lèi)型等，阻斷干擾物質(zhì)與檢測(cè)抗體的非特異性結(jié)合，不影響目標(biāo)抗原-抗體的特異性反應(yīng)。
1.針對(duì)異嗜性抗體（HAMA）的阻斷設(shè)計(jì)
異嗜性抗體多為針對(duì)動(dòng)物源性抗體（如鼠、兔、羊）的多克隆抗體，可同時(shí)結(jié)合捕獲抗體和酶標(biāo)二抗的恒定區(qū)（Fc段），形成“捕獲抗體-HAMA-酶標(biāo)二抗”的假陽(yáng)性復(fù)合物。
核心阻斷策略：添加動(dòng)物血清/IgG阻斷劑（最常用）
原理：在反應(yīng)體系中加入過(guò)量的、與試劑盒抗體同源的動(dòng)物血清（如試劑盒抗體為鼠源，則加入正常鼠血清）或純化IgG，優(yōu)先占據(jù)HAMA的結(jié)合位點(diǎn)，使其無(wú)法再結(jié)合檢測(cè)抗體的Fc段。
具體方案：
在包被液、封閉液或樣本稀釋液中添加1-5%的同源動(dòng)物血清（如鼠血清、兔血清）；
若試劑盒使用多種動(dòng)物源抗體（如鼠源捕獲抗體+羊源酶標(biāo)二抗），可添加“混合動(dòng)物血清”（如鼠+羊血清）或商業(yè)化HAMA阻斷劑（如Sigma的HAMABlockingReagent）。
輔助優(yōu)化：使用“Fab片段抗體”作為檢測(cè)抗體
原理：Fab片段僅含抗原結(jié)合區(qū)（無(wú)Fc段），而異嗜性抗體主要結(jié)合Fc段，因此使用Fab片段可避免HAMA的非特異性結(jié)合，從根本上消除此類(lèi)干擾。
2.針對(duì)類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）的阻斷設(shè)計(jì)
RF是針對(duì)人IgGFc段的自身抗體，可同時(shí)結(jié)合樣本中可能存在的內(nèi)源性IgG（或檢測(cè)體系中的人源抗體）和酶標(biāo)二抗的Fc段，形成“內(nèi)源性IgG-RF-酶標(biāo)二抗”的假陽(yáng)性復(fù)合物。
核心阻斷策略：添加人IgG阻斷劑或抗RF抗體
方案1：在樣本稀釋液中加入過(guò)量純化人IgG（1-10mg/mL），優(yōu)先與RF結(jié)合，占據(jù)其結(jié)合位點(diǎn)，阻止RF與檢測(cè)體系中的IgG（如捕獲抗體為抗人IgG時(shí)）或酶標(biāo)二抗結(jié)合；
方案2：使用抗RF單克隆抗體作為阻斷劑，特異性結(jié)合樣本中的RF并中和其活性，避免其介導(dǎo)非特異性交聯(lián)。
輔助優(yōu)化：優(yōu)化反應(yīng)pH和離子強(qiáng)度
RF的非特異性結(jié)合依賴于Fc段的構(gòu)象，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)緩沖液的pH（如5.5-6.0，偏離RF的最適結(jié)合pH）或增加NaCl濃度（0.15-0.5M），可減弱RF與抗體的非特異性相互作用。
3.通用型阻斷設(shè)計(jì)（同時(shí)應(yīng)對(duì)多種干擾）
添加封閉蛋白混合物：在封閉液中除了常規(guī)的BSA、脫脂奶粉外，加入少量動(dòng)物血清（如5%胎牛血清）、魚(yú)明膠或酪蛋白，形成更致密的封閉層，覆蓋酶標(biāo)板上未結(jié)合抗體的位點(diǎn)，同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合樣本中的非特異性結(jié)合物質(zhì)（包括HAMA、RF、其他雜抗體）。
使用“阻斷緩沖液”作為樣本稀釋液：將樣本用含高濃度封閉劑的緩沖液稀釋?zhuān)ㄈ绾?%BSA+1%鼠血清+0.05%Tween-20的PBS），既降低樣本中干擾物質(zhì)的濃度，又通過(guò)封閉劑提前占據(jù)干擾物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。
二、樣本預(yù)處理層面：提前去除或中和干擾物質(zhì)
對(duì)于干擾物質(zhì)濃度較高的樣本（如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清、多次接受動(dòng)物源性抗體治療的患者樣本），僅靠試劑盒阻斷可能效果有限，需在檢測(cè)前對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，直接去除或中和干擾物。
1.針對(duì)HAMA的樣本預(yù)處理
方法1：親和層析去除HAMA
原理：使用與試劑盒抗體同源的動(dòng)物IgG（如鼠IgG）偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠柱，樣本過(guò)柱時(shí)，HAMA會(huì)特異性結(jié)合到凝膠上的鼠IgG，而目標(biāo)抗原則穿透柱子被收集，從而實(shí)現(xiàn)分離。
簡(jiǎn)化方案：使用商品化的HAMA去除試劑盒（如Thermo的HAMARemovalSpinColumns），操作快速，適合小批量樣本。
方法2：樣本與動(dòng)物IgG預(yù)孵育
操作：將樣本與過(guò)量的同源動(dòng)物IgG（如1mg/mL鼠IgG）在室溫下孵育30分鐘，讓HAMA充分結(jié)合鼠IgG，再將孵育后的樣本加入ELISA反應(yīng)體系，此時(shí)HAMA已被中和，無(wú)法結(jié)合檢測(cè)抗體。
2.針對(duì)RF的樣本預(yù)處理
方法1：熱變性滅活RF
原理：RF的活性依賴于其天然構(gòu)象，將樣本置于56℃水浴30分鐘，可使RF的空間結(jié)構(gòu)破壞而失活，同時(shí)不影響大多數(shù)抗原（如蛋白質(zhì)類(lèi)抗原）的活性。
注意：需驗(yàn)證目標(biāo)抗原的熱穩(wěn)定性，若抗原對(duì)熱敏感（如激素、細(xì)胞因子），則避免此方法。
方法2：親和吸附去除RF
原理：使用人IgG偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠（如ProteinA/G瓊脂糖，可結(jié)合IgG的Fc段），樣本過(guò)柱時(shí)，RF會(huì)特異性結(jié)合人IgG，而目標(biāo)抗原（若為非IgG類(lèi)物質(zhì)）則被收集。
適用場(chǎng)景：目標(biāo)抗原不是IgG（如小分子抗原、細(xì)胞因子），若目標(biāo)抗原是IgG（如檢測(cè)自身抗體），則需避免（會(huì)同時(shí)去除目標(biāo)抗原）。
方法3：使用RF吸附劑
商品化RF吸附劑（如抗人RF抗體偶聯(lián)磁珠），可特異性結(jié)合樣本中的RF，通過(guò)磁分離去除，操作簡(jiǎn)便，不影響目標(biāo)抗原。
3.通用型樣本預(yù)處理（應(yīng)對(duì)多種干擾）
方法1：PEG沉淀去除大分子干擾物
原理：HAMA、RF多為大分子免疫球蛋白（IgG、IgM類(lèi)），而小分子目標(biāo)抗原（如分子量<10kDa的細(xì)胞因子）可通過(guò)PEG沉淀分離。
操作：向樣本中加入PEG6000至終濃度8-10%，4℃靜置30分鐘后離心（10000g，10分鐘），取上清液檢測(cè)（上清中含目標(biāo)抗原，沉淀中含大分子干擾物）。
方法2：樣本稀釋法
原理：干擾物質(zhì)的非特異性結(jié)合具有濃度依賴性，通過(guò)將樣本用ELISA稀釋液（含封閉劑）進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)ㄈ?:10、1:20），可降低干擾物質(zhì)的濃度，使其非特異性結(jié)合能力減弱。
注意：需確保目標(biāo)抗原的濃度在試劑盒的檢測(cè)范圍內(nèi)，避免稀釋后抗原濃度過(guò)低導(dǎo)致假陰性。
方法3：酸/堿處理中和干擾
原理：部分干擾物質(zhì)（如RF）在極端pH下會(huì)失活，而目標(biāo)抗原可通過(guò)中和后恢復(fù)活性。
操作：將樣本用0.1MHCl調(diào)至pH2.0，室溫孵育10分鐘，再用0.1MNaOH中和至pH7.4，離心后取上清檢測(cè)。
三、關(guān)鍵優(yōu)化原則與驗(yàn)證方法
阻斷劑/預(yù)處理方法的特異性：
需驗(yàn)證阻斷劑僅結(jié)合干擾物質(zhì)，不與目標(biāo)抗原或檢測(cè)抗體結(jié)合（如通過(guò)空白對(duì)照、抗原標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證，確保添加阻斷劑后標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、截距無(wú)顯著變化）。
避免過(guò)度阻斷：
過(guò)量的阻斷劑（如高濃度動(dòng)物血清）可能導(dǎo)致非特異性背景升高，需通過(guò)梯度實(shí)驗(yàn)確定最佳濃度（如0.5%、1%、2%、5%的血清濃度梯度，選擇背景最低且信號(hào)無(wú)衰減的濃度）。
干擾驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：
用已知含高濃度HAMA/RF的樣本（如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清、HAMA陽(yáng)性對(duì)照品）進(jìn)行驗(yàn)證，比較處理前后的檢測(cè)結(jié)果，確保假陽(yáng)性率顯著降低。
試劑盒兼容性：
樣本預(yù)處理（如PEG沉淀、酸處理）可能影響樣本的基質(zhì)，需驗(yàn)證處理后的樣本與試劑盒的反應(yīng)體系兼容（如通過(guò)回收實(shí)驗(yàn)，添加已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品，驗(yàn)證回收率在80%-120%之間）。
