不同類型ELISA試劑盒的背景信號來源存在差異，如何針對性優(yōu)化封閉液成分、洗滌條件以降低非特異性結(jié)合？

日期：2025-11-14 11:44:04

不同類型ELISA的背景信號來源因反應(yīng)原理差異而不同，需針對性優(yōu)化封閉液和洗滌條件以降低非特異性結(jié)合。以下是具體分析及優(yōu)化策略：

一、不同ELISA方法的背景信號來源

1.直接法ELISA

原理：
酶標(biāo)一抗直接結(jié)合抗原，無需二抗。

背景來源：

酶標(biāo)一抗非特異性吸附到固相載體（如ELISA板孔）表面；

一抗與樣本中其他非目標(biāo)抗原的交叉反應(yīng)；

酶標(biāo)記物自身的非特異性活性（如酶與載體的直接結(jié)合）。

2.間接法ELISA

原理：
一抗結(jié)合抗原后，酶標(biāo)二抗（抗一抗的抗體）結(jié)合一抗，信號放大。

背景來源：

二抗與固相載體的非特異性吸附（二抗多為多克隆抗體，交叉反應(yīng)性更高）；

二抗與樣本中雜蛋白（如Fc受體、其他免疫球蛋白）的交叉結(jié)合；

一抗未完全封閉載體表面，導(dǎo)致二抗額外吸附。

3.雙抗體夾心法ELISA

原理：
固相捕獲抗體與抗原結(jié)合，酶標(biāo)檢測抗體再結(jié)合抗原（形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”夾心）。

背景來源：

捕獲抗體與檢測抗體的非特異性交叉反應(yīng)（如兩者來源種屬接近時的相互結(jié)合）；

檢測抗體非特異性吸附到固相載體或捕獲抗體上；

樣本中雜蛋白同時結(jié)合捕獲抗體和檢測抗體（模擬抗原的“橋聯(lián)”作用）。

二、針對性優(yōu)化策略

1、封閉液成分優(yōu)化（核心：阻斷載體未結(jié)合位點(diǎn)，減少非特異性吸附）

（1）直接法ELISA

核心需求：優(yōu)先阻斷載體表面，減少酶標(biāo)一抗的非特異性吸附。

推薦封閉液：

5%脫脂奶粉（含酪蛋白，性價比高，適用于多數(shù)一抗，尤其抗體制備中使用牛奶來源抗原時）；

1%–3%BSA（牛血清白蛋白，純度高，適用于一抗對奶粉成分敏感的場景，如磷酸化抗體）；

特殊情況：若酶標(biāo)一抗含F(xiàn)c段，可添加0.05%–0.1%吐溫-20（降低疏水相互作用），或加入與一抗無關(guān)的動物血清（如10%山羊血清，封閉載體上的Fc結(jié)合位點(diǎn)）。

（2）間接法ELISA

核心需求：同時阻斷載體和一抗未覆蓋的位點(diǎn)，減少二抗的非特異性結(jié)合。

推薦封閉液：

5%脫脂奶粉+0.05%吐溫-20（吐溫可破壞二抗與載體的疏水吸附）；

10%與二抗來源無關(guān)的動物血清（如二抗為羊抗鼠，則用牛血清，避免血清中IgG與二抗交叉反應(yīng)）；

避免使用與一抗同來源的血清（如兔源一抗，禁用兔血清封閉，否則血清中IgG會被二抗識別）。

（3）雙抗體夾心法ELISA

核心需求：阻斷載體和捕獲抗體的非特異性位點(diǎn)，避免檢測抗體與捕獲抗體的交叉結(jié)合。

推薦封閉液：

3%–5%BSA（純度高，減少雜蛋白干擾，避免奶粉中可能存在的與抗原類似的成分）；

若捕獲抗體和檢測抗體存在交叉反應(yīng)，可在封閉液中加入過量的非標(biāo)記檢測抗體（或無關(guān)同型抗體），預(yù)先封閉捕獲抗體上的交叉位點(diǎn)；

緩沖液選擇：用PBS而非Tris緩沖液（Tris可能干擾某些抗原-抗體結(jié)合），pH7.2–7.4最佳。

2、洗滌條件優(yōu)化（核心：去除未結(jié)合的游離抗體/抗原，減少殘留信號）

（1）直接法ELISA

洗滌液：PBS+0.05%吐溫-20（T-PBS），吐溫濃度可略提高至0.1%（增強(qiáng)對酶標(biāo)一抗非特異性吸附的洗脫）；

洗滌次數(shù)與時間：3–5次，每次30秒–1分鐘（避免過度洗滌導(dǎo)致一抗與抗原解離）；

輔助操作：洗滌后倒扣板孔，用吸水紙拍干（避免殘留液體中的游離酶標(biāo)物）。

（2）間接法ELISA

洗滌液：T-PBS（吐溫0.05%），二抗孵育后需增加洗滌強(qiáng)度（因二抗非特異性吸附更強(qiáng)）；

洗滌次數(shù)與時間：5次，每次1分鐘，最后一次可延長至2分鐘（確保去除游離二抗）；

特殊處理：若背景因樣本中雜蛋白引起（如血清樣本），可在洗滌液中加入0.1MNaCl（增強(qiáng)離子強(qiáng)度，促進(jìn)雜蛋白解離）。

（3）雙抗體夾心法ELISA

洗滌液：T-PBS（吐溫0.02%–0.05%，避免高濃度吐溫破壞“夾心”復(fù)合物）；

洗滌次數(shù)與時間：捕獲抗體包被后洗滌3次，抗原孵育后4次，檢測抗體孵育后5次（重點(diǎn)去除檢測抗體與捕獲抗體的非特異性結(jié)合）；

溫度控制：洗滌液室溫放置（避免低溫導(dǎo)致蛋白結(jié)合更緊密，難以洗脫）。

三、通用補(bǔ)充優(yōu)化措施

封閉時間與溫度：37℃封閉1小時或4℃過夜（確保載體表面充分飽和），避免封閉時間過短（<30分鐘）導(dǎo)致封閉不徹底。

樣本預(yù)處理：含高雜蛋白的樣本（如血清、細(xì)胞裂解液）可預(yù)先用稀釋液（含封閉劑）稀釋，減少樣本中成分的非特異性吸附。

抗體濃度優(yōu)化：通過梯度稀釋確定一抗/二抗的最佳工作濃度（過高濃度易導(dǎo)致非特異性結(jié)合，遵循“信號/背景比最高”原則）。

直接法需重點(diǎn)阻斷酶標(biāo)一抗的載體吸附，間接法需抑制二抗的交叉反應(yīng)，雙抗體夾心法需避免捕獲抗體與檢測抗體的相互作用。通過匹配封閉液成分（奶粉/BSA/血清）和洗滌強(qiáng)度（吐溫濃度、次數(shù)），可將背景信號降低50%以上，顯著提升ELISA的特異性和信噪比。