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用ELISA檢測試劑盒繪制標準曲線時,R2值偏低該排查哪些環節?

日期:2025-11-06 14:54:12

    R²值偏低核心是標準曲線擬合度差,需從標準品處理、操作過程、儀器與試劑、擬合方法四個核心環節排查。

1. 標準品相關問題
    標準品溶解不當:未用試劑盒配套稀釋液,或溶解時未充分渦旋、靜置時間不足,導致濃度不均。
    標準品稀釋誤差:稀釋過程中移液不準確(如槍頭未潤洗、量程選擇不當),或稀釋梯度配制時體積偏差。
    標準品穩定性差:反復凍融、儲存溫度不當(未按說明書要求冷藏/冷凍),導致標準品降解。
 
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2. 實驗操作與反應條件
    加樣操作不規范:加樣速度過慢、液體掛壁,或不同孔位加樣量不一致。
    孵育條件失控:孵育溫度偏離試劑盒要求(如37℃±1℃)、孵育時間不足/過長,或濕盒內濕度不夠導致邊緣效應。
    洗滌步驟問題:洗滌液未充分浸潤孔壁、洗滌次數不足(殘留未結合酶標物),或洗滌時用力過猛導致包被抗原脫落。
    底物反應異常:底物添加后未及時檢測,或反應溫度、時間不當,導致產物信號過強/過弱。
 
3. 試劑與儀器因素
    試劑失效或配伍錯誤:試劑盒過期、試劑未平衡至室溫(直接使用冷藏試劑),或不同品牌/批次試劑混用。
    酶標儀問題:檢測波長選擇錯誤、儀器校準過期,或孔位掃描時存在氣泡、劃痕干擾讀數。
 
4. 數據處理與擬合方式
    擬合模型選擇不當:將非線性濃度 - 信號關系強行用線性模型擬合(如應選四參數logistic模型卻用線性回歸)。
    異常值未合理處理:標準曲線中存在明顯偏離的孔位(如污染、操作失誤導致),未剔除或驗證直接擬合。