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RNA pulldown試劑盒實驗中,探針的設計與標記需注意什么?

日期:2025-10-20 15:44:13

    探針設計與標記是RNApulldown實驗成功的關鍵,直接影響靶蛋白捕獲的特異性和效率。實驗中需重點注意探針的序列設計、化學修飾、標記方式及質量控制這四大核心環節。
一、探針序列設計:保證特異性與結合效率
    探針序列決定了其能否精準結合目標RNA,需規避非特異性結合風險。
    靶向區域選擇:優先選擇目標RNA的特異性區域,如mRNA的3'UTR、5'UTR或特定功能結構域(如lncRNA的蛋白結合結構域)。避免選擇高度保守的重復序列或與其他RNA同源性高的區域,減少交叉結合。
    探針長度控制:通常設計為50-100nt。過短(<30nt)會導致結合親和力不足,易脫落;過長(>150nt)可能形成自身二級結構,影響與靶蛋白或目標RNA的結合,且合成難度和成本增加。
    GC含量優化:GC含量控制在40%-60%。過高(>65%)易導致探針自身退火或非特異性結合;過低(<35%)則會降低探針與目標RNA的結合穩定性,可通過調整堿基序列平衡GC分布。
 
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二、探針化學修飾:提升穩定性與結合能力
    化學修飾可增強探針的抗降解能力,同時避免對蛋白結合造成干擾。
    抗核酸酶修飾:在探針的5'端和3'端添加磷酸化、2'-O-甲基(2'-O-Me)或硫代磷酸酯(PS)修飾。這些修飾能抵抗實驗體系中核酸酶的降解,延長探針半衰期,尤其適用于從細胞裂解液中捕獲靶蛋白的場景。
    避免干擾修飾:修飾位點需避開目標RNA與靶蛋白的結合區域。例如,若已知蛋白結合于RNA的特定堿基位點,該區域的探針不應進行修飾,防止空間位阻阻礙蛋白結合。
 
三、探針標記方式:確保可捕獲性與低干擾
    標記的核心是引入“捕獲標簽”,同時不影響探針與目標RNA、靶蛋白的相互作用。
    標記類型選擇:常用生物素(Biotin)標記,因其與鏈霉親和素(Streptavidin)的結合特異性極強且親和力高,是目前最主流的選擇。避免使用對RNA-蛋白相互作用有潛在影響的標記物(如熒光素),除非實驗有特殊檢測需求。
    標記位點與數量:優先選擇5'端或3'端標記,避免在探針中間位點標記,減少對RNA二級結構和蛋白結合位點的破壞。通常單個探針標記1個生物素分子即可滿足捕獲需求,過多標記可能導致探針溶解性下降或非特異性吸附。
    標記效率驗證:標記完成后需通過HPLC或瓊脂糖凝膠電泳驗證標記效率。生物素標記效率需≥90%,效率過低會導致探針無法被有效捕獲,直接降低實驗回收率。
 
四、對照探針設計:排除非特異性信號
    對照探針是判斷實驗結果可靠性的關鍵,必須與目標探針同步設計和處理。
    陰性對照探針:設計與目標探針長度、GC含量相近的無關序列探針(如scramble序列),且需確認該序列不與樣本中的任何RNA或蛋白發生特異性結合。用于排除探針自身非特異性吸附的蛋白信號。
    陽性對照探針:若已知目標RNA的某一區域可與特定蛋白結合,可設計該區域的探針作為陽性對照。用于驗證實驗體系是否正常,確保鏈霉親和素beads、裂解液等試劑無問題。
    處理一致性:對照探針需與目標探針進行相同的化學修飾和標記,確保實驗條件一致,避免因處理差異導致的結果偏差。