洗滌步驟在ELISA檢測中起到什么作用，常見的洗滌液成分有哪些，洗滌次數(shù)該如何把控？

日期：2025-09-16 14:39:55

在ELISA檢測中，洗滌步驟是消除非特異性結(jié)合、降低背景信號、確保結(jié)果特異性和準(zhǔn)確性的 “關(guān)鍵質(zhì)控環(huán)節(jié)”，其核心目標(biāo)是移除未結(jié)合的干擾物質(zhì)，僅保留特異性結(jié)合的抗原-抗體-酶復(fù)合物。以下從作用、成分、洗滌次數(shù)三方面展開解析：

一、洗滌步驟的核心作用：排除干擾，純化特異性結(jié)合信號

ELISA的反應(yīng)體系（如包被板孔內(nèi)）存在大量 “非特異性結(jié)合物質(zhì)”（如未結(jié)合的抗體、游離酶標(biāo)物、樣本中的雜蛋白等），這些物質(zhì)若不清除，會與底物反應(yīng)產(chǎn)生 “假陽性信號” 或拉高背景值，導(dǎo)致結(jié)果誤判。洗滌步驟的本質(zhì)是通過物理沖洗，選擇性保留特異性結(jié)合的復(fù)合物（如包被抗體 - 抗原 - 酶標(biāo)抗體復(fù)合物），移除所有游離干擾物，具體作用可分為 3 點：

1、移除未結(jié)合的抗體/酶標(biāo)物，避免假陽性

例如：在 “雙抗體夾心法” 中，加入酶標(biāo)抗體后，部分酶標(biāo)抗體會因 “疏水作用” 或 “非特異性吸附” 黏附在板孔壁上（未與抗原結(jié)合）。若不洗滌，這些游離的酶標(biāo)抗體會與后續(xù)加入的底物反應(yīng)，產(chǎn)生 “無特異性的顏色信號”，導(dǎo)致原本陰性的樣本被誤判為陽性（假陽性）。

2、降低背景信號，提升檢測靈敏度

樣本中的雜蛋白（如血清中的白蛋白、球蛋白）、試劑中的微量雜質(zhì)也會非特異性吸附在板孔表面，這些物質(zhì)雖不直接與酶反應(yīng)，但會增加 “背景吸光度”（即空白孔或陰性對照孔的信號值）。洗滌可移除這些雜蛋白，使背景信號降至最低，從而更清晰地區(qū)分 “陽性信號” 與 “背景信號”，提升對低濃度目標(biāo)抗原的檢測靈敏度。

3、終止前一步反應(yīng)，避免交叉干擾

部分 ELISA 步驟（如封閉、一抗孵育）后，殘留的試劑（如封閉液中的BSA、未結(jié)合的一抗）可能與后續(xù)試劑（如二抗、酶標(biāo)物）發(fā)生非特異性反應(yīng)。洗滌可徹底移除前一步的殘留試劑，確保后續(xù)反應(yīng)僅在 “特異性結(jié)合復(fù)合物” 的基礎(chǔ)上進行，避免步驟間的交叉干擾。

二、常見洗滌液的成分：以 “緩沖液+表面活性劑” 為核心

ELISA洗滌液的設(shè)計需滿足兩個核心需求：保持特異性結(jié)合復(fù)合物的穩(wěn)定（不破壞抗原-抗體結(jié)合）、高效移除游離物質(zhì)。因此，其成分通常以 “中性緩沖液” 為基礎(chǔ)，添加 “表面活性劑” 增強洗滌效果，常見配方如下：

成分類別	核心作用	常見物質(zhì)及說明
基礎(chǔ)緩沖液	維持反應(yīng)體系pH穩(wěn)定，避免抗原抗體解離	PBS（磷酸緩沖鹽溶液）：最常用，pH 7.2-7.4，滲透壓與生理環(huán)境接近，能穩(wěn)定抗原抗體結(jié)合； Tris-HCl緩沖液：pH 7.4-8.0，適用于對 pH 更敏感的抗體體系，穩(wěn)定性略高于 PBS；注意：緩沖液需不含金屬離子（如Zn²?、Cu²?），避免抑制酶活性（如 HRP 酶對金屬離子敏感）。
表面活性劑	降低表面張力，增強對非特異性吸附物的洗脫	Tween-20：最常用，濃度0.05%-0.1%，溫和且不破壞抗原抗體結(jié)合，能有效洗脫板孔壁上的非特異性吸附蛋白； Tween-80：與Tween-20作用類似，但親水性稍弱，多用于脂肪含量較高的樣本（如血漿）洗滌；注意：表面活性劑濃度不可過高（>0.5%），否則會破壞特異性結(jié)合，導(dǎo)致信號降低。
防腐劑（可選）	防止洗滌液在儲存過程中滋生細菌、霉菌	疊氮鈉（NaN?）：濃度0.02%-0.05%，抑菌效果強，但嚴禁用于 HRP 酶體系（疊氮鈉會強烈抑制HRP活性）；硫柳汞：濃度0.01%，適用于HRP、AP（堿性磷酸酶）體系，兼容性更廣；商用洗滌液多已添加防腐劑，自配時需根據(jù)酶種類選擇。

關(guān)鍵注意點：

商用 ELISA 試劑盒通常會提供 “專用濃縮洗滌液”，需按說明書比例（如1:20、1:50）用無酶純水稀釋后使用，避免因濃度不當(dāng)影響洗滌效果；

洗滌液需現(xiàn)配現(xiàn)用（或在規(guī)定條件下儲存，如 2-8℃保存1個月內(nèi)），避免反復(fù)凍融或長期放置導(dǎo)致成分降解（如表面活性劑氧化）。

三、洗滌次數(shù)的把控：“3-5 次” 為通用標(biāo)準(zhǔn)，需結(jié)合步驟和說明書調(diào)整

洗滌次數(shù)并非越多越好（過度洗滌可能破壞特異性結(jié)合），也不能過少（洗滌不足會殘留干擾物），需根據(jù)ELISA的具體步驟、試劑特性和樣本類型靈活調(diào)整，核心原則是 “確保無游離干擾物殘留，同時不損失特異性信號”。

1. 通用洗滌次數(shù)：每步反應(yīng)后洗滌3-5次，每次浸泡1-2分鐘

對于ELISA的關(guān)鍵步驟（如一抗孵育后、二抗/酶標(biāo)物孵育后），常規(guī)洗滌次數(shù)為35次，每次向板孔內(nèi)加入足量洗滌液（如每孔200-300μL，約為孔容積的2/3），并浸泡 1-2 分鐘（即 “浸泡式洗滌”）—— 浸泡可讓洗滌液充分接觸孔壁，洗脫非特異性吸附物；

每次洗滌后需徹底拍干（將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上，輕輕拍打去除殘留洗滌液，避免孔內(nèi)積水），若殘留洗滌液，會稀釋后續(xù)試劑（如底物），導(dǎo)致信號降低。

2. 按步驟調(diào)整：高干擾步驟需增加洗滌次數(shù)

不同步驟的 “干擾風(fēng)險” 不同，需針對性調(diào)整洗滌次數(shù)：

封閉后：封閉液（如BSA、脫脂奶）若殘留，會與抗體非特異性結(jié)合，通常洗滌2-3 次即可（封閉液多為水溶性，易洗脫）；

一抗/二抗孵育后：抗體易非特異性吸附，且殘留的酶標(biāo)二抗會直接導(dǎo)致假陽性，需洗滌4-5 次（關(guān)鍵步驟，寧可多洗 1 次，避免干擾）；

底物反應(yīng)前：此步驟洗滌需格外徹底（通常 5 次），若殘留酶標(biāo)物，會直接與底物反應(yīng)，產(chǎn)生高背景，導(dǎo)致結(jié)果無效。

3. 特殊情況：樣本類型與試劑盒說明書優(yōu)先

高背景樣本：若檢測樣本為血清、血漿、組織勻漿（含大量雜蛋白），或預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)背景值過高，可在常規(guī)次數(shù)基礎(chǔ)上增加1-2次洗滌，或延長每次浸泡時間（至3分鐘），但需注意：過度洗滌（如>6次）可能導(dǎo)致特異性結(jié)合的復(fù)合物解離，尤其是低親和力抗體體系，需通過預(yù)實驗驗證；

遵循試劑盒說明書：商用試劑盒會明確標(biāo)注每步的洗滌次數(shù)（如 “一抗孵育后洗滌5次，每次30秒”），需嚴格遵循 —— 不同試劑盒的抗體親和力、酶標(biāo)物濃度不同，說明書的洗滌方案是經(jīng)過驗證的最優(yōu)條件，擅自更改可能導(dǎo)致結(jié)果偏差。

洗滌作用：核心是 “去干擾、保特異”，通過移除未結(jié)合物質(zhì)，降低背景信號，避免假陽性，確保結(jié)果準(zhǔn)確；

洗滌液成分：以PBS/Tris-HCl（緩沖穩(wěn)定）+Tween-20（增強洗脫）為基礎(chǔ)，可選加防腐劑（需匹配酶種類）；

洗滌次數(shù)：通用為每步3-5次（關(guān)鍵步驟4-5次），需結(jié)合樣本類型（高背景樣本可多洗1次），并嚴格遵循試劑盒說明書，同時注意 “徹底浸泡 + 拍干”，避免殘留。