當ELISA檢測結果超出標準曲線范圍時,該如何處理樣本以獲得準確結果?
日期:2025-09-16 14:22:04
當ELISA檢測結果超出標準曲線范圍(即 “超出線性范圍”,包括高于標準曲線上限和低于標準曲線下限兩種情況)時,直接讀取的結果會因反應信號非線性(如抗體飽和、底物耗盡或信號低于檢測限)而嚴重偏離真實值,需通過針對性樣本處理重新檢測以獲得準確結果。以下是具體處理方案、原理及注意事項:
二、針對性處理方案:分情況操作
一、核心判斷:先明確 “超出范圍” 的類型
首先需結合標準曲線的線性區間(通常由試劑盒說明書明確標注,如 “10-1000 pg/mL”),判斷樣本結果是 “超上限” 還是 “超下限”,二者處理邏輯完全不同:
| 超出類型 | 表現特征 | 核心問題 | 處理原則 |
| 超上限(HighDoseHook效應/信號飽和) | 樣本OD值顯著高于標準曲線最高濃度點的OD值,或OD值不再隨濃度升高而增加(平臺期) | 抗原濃度過高,導致捕獲抗體/檢測抗體完全飽和,反應信號無法線性放大,甚至出現“鉤狀效應”(高濃度反而信號降低) | 稀釋樣本,使稀釋后濃度落入標準曲線線性區間 |
| 超下限(LowDetectionLimit) | 樣本OD值低于標準曲線最低濃度點的OD值,或接近空白對照OD值 | 抗原濃度過低,信號弱于檢測方法的最低分辨能力,無法與背景噪音有效區分 | 濃縮樣本,或使用更靈敏的檢測方案(如提高抗體濃度、延長孵育時間) |

二、針對性處理方案:分情況操作
1. 結果 “超上限”:樣本稀釋法(最常用)
稀釋是解決 “超上限” 的核心手段,關鍵是選擇合適的稀釋倍數,確保稀釋后樣本濃度落在標準曲線的 “中間線性區”(而非僅接近上限),避免二次超范圍。
操作步驟:
選擇稀釋液:必須使用試劑盒配套的 “樣本稀釋液”(含封閉劑、穩定劑,可減少非特異性結合),嚴禁用純水、PBS 或生理鹽水稀釋(會導致基質效應,影響反應效率)。
確定初始稀釋倍數:
若樣本 OD 值略高于標準曲線上限(如上限 OD=2.0,樣本 OD=2.2):先嘗試1:5 或 1:10 倍稀釋(體積比,如 10μL 樣本 + 40μL 稀釋液 = 1:5 稀釋)。
若樣本 OD 值遠高于上限(如上限 OD=2.0,樣本 OD=3.5):直接采用1:100 或更高倍數稀釋(避免多次稀釋引入誤差),后續可根據稀釋后結果調整(如稀釋后仍超上限,需進一步提高倍數;若低于下限,需降低倍數)。
稀釋操作規范:
采用 “梯度稀釋”(如 1:10→1:100→1:1000),每次稀釋后充分混勻(使用渦旋振蕩器,避免濃度不均)。
稀釋過程中使用帶濾芯的移液器吸頭,防止樣本交叉污染;所有容器(如離心管)需提前滅菌或使用一次性耗材。
重新檢測與結果計算:稀釋后樣本需與標準曲線同步檢測(同一塊酶標板,避免批次差異),最終濃度 = 稀釋后檢測濃度 × 稀釋倍數(如 1:100 稀釋后檢測值為 50 pg/mL,真實濃度 = 50×100=5000 pg/mL)。
2. 結果 “超下限”:樣本濃縮或方法優化
當樣本濃度低于標準曲線下限時,需通過 “濃縮樣本” 提高抗原濃度,或優化檢測條件增強信號,具體方案如下:
方案 1:樣本濃縮(適用于液體樣本,如血清、血漿、細胞上清)
常用濃縮方法:
離心濃縮法:使用截留分子量與目標抗原匹配的 “離心濃縮管”(如目標抗原分子量為 50 kDa,選擇 30 kDa 截留管),10000-12000×g 離心 10-30 分鐘(根據需要的濃縮倍數調整時間),棄透過液,保留濃縮液(濃縮倍數 = 濃縮前體積 / 濃縮后體積,如 1mL 樣本濃縮至 100μL,即 10 倍濃縮)。
優點:操作快、無添加劑污染;缺點:可能損失部分小分子抗原(需匹配截留分子量)。
真空冷凍干燥法:將樣本置于凍干機中,-50~-60℃真空凍干至完全干燥,再用少量樣本稀釋液(如原體積的 1/10~1/50)復溶,實現濃縮。
優點:適用于熱敏性抗原,濃縮倍數高;缺點:耗時較長(需數小時),需避免復溶不充分(需渦旋 + 靜置 10 分鐘)。
注意事項:濃縮后樣本需充分混勻,且復溶體積需精確記錄(用于計算最終濃度);濃縮過程中可能伴隨雜質(如鹽類、小分子蛋白)同步濃縮,需提前確認是否影響 ELISA 反應(可做空白對照驗證)。
方案 2:檢測方法優化(無需處理樣本,提升信號靈敏度)
若樣本量極少或濃縮困難(如組織勻漿),可通過優化 ELISA 反應條件增強信號,使低濃度樣本信號落入檢測范圍:
延長孵育時間:將 “抗原 - 捕獲抗體” 孵育時間從 1 小時(37℃)延長至 2 小時,或 4℃過夜孵育(增加抗原與抗體的結合效率)。
提高抗體濃度:在試劑盒允許范圍內,將檢測抗體濃度提高 1.5-2 倍(需先做預實驗驗證,避免非特異性信號升高)。
延長底物反應時間:底物孵育時間從 15 分鐘延長至 20-25 分鐘(注意觀察,避免底物耗盡導致信號平臺期)。
更換高靈敏度底物:如將 TMB 底物(常規靈敏度)更換為 “增強型 TMB 底物” 或 “化學發光底物”(靈敏度可提升 10-100 倍,適用于極微量抗原)。
三、關鍵注意事項:避免誤差,確保結果可靠
嚴格遵循試劑盒說明書:所有稀釋液、孵育時間、溫度需以說明書為準(不同試劑盒的抗體特異性、反應體系不同,擅自更改可能導致結果偏差)。
做 “稀釋驗證實驗”:若樣本濃度未知,建議同時做 3-5 個梯度稀釋(如 1:10、1:100、1:1000),確保至少 1 個稀釋倍數的結果落在標準曲線線性區,避免單一稀釋倍數導致的誤判。
設置質量控制(QC)樣本:每次重新檢測需加入 “已知濃度的 QC 樣本”(如高、中、低濃度質控品),若 QC 結果在允許范圍內(通常 CV<10%),方可確認檢測有效。
避免 “過度稀釋”:稀釋倍數過高(如 1:10000 以上)可能導致樣本中抗原濃度低于檢測限,或引入稀釋誤差(如移液器吸量不準確),需根據標準曲線上限合理選擇(通常稀釋后濃度落在標準曲線 1/3~2/3 區間最準確)。
超下限結果的報告原則:若濃縮后仍無法檢測到信號,需在報告中注明 “結果 < 標準曲線下限(如 < 10 pg/mL)”,而非直接報告 “0”,避免誤導結論。
ELISA 結果超出標準曲線范圍時,需先判斷 “超上限” 還是 “超下限”:
超上限:優先用試劑盒配套稀釋液進行梯度稀釋,確保稀釋后濃度落入線性區,再重新檢測并換算真實濃度;
超下限:優先通過離心濃縮或凍干濃縮提高抗原濃度,或優化孵育時間、抗體濃度等條件增強信號,若仍無法檢測,需標注 “低于檢測限”。
核心原則是:通過處理使樣本反應信號處于標準曲線的線性區間內,同時嚴格控制操作誤差(如稀釋混勻、避免污染),確保結果準確可靠。






