ELISA試劑盒通常包含哪些基本試劑組分?
日期:2025-08-25 14:31:33
ELISA酶聯免疫吸附試驗試劑盒的核心是通過抗原-抗體特異性結合與酶促反應實現檢測,其試劑組分需圍繞 “特異性結合”“信號放大”“結果校準” 三大核心功能設計。不同類型ELISA(如間接法、雙抗體夾心法、競爭法)的組分存在細微差異,但基本試劑框架高度統一,具體可分為以下6大類,每類組分的功能與作用機制如下:
二、酶標記相關試劑:實現 “信號轉換與放大”
六、樣本稀釋液/封閉液:優化 “反應環境”
七、不同 ELISA 類型的組分差異總結

一、特異性結合試劑:實現 “靶標捕獲/識別”
這類試劑是 ELISA 特異性的核心,直接決定檢測能否精準結合目標分子(抗原或抗體),不同檢測模式的試劑組合不同。
| 試劑類型 | 核心功能 | 常見形式與說明 |
| 包被抗體/抗原 | 固定在酶標板孔內,作為 “捕獲分子” 結合靶標 | 雙抗體夾心法:包被捕獲抗體(針對靶抗原的特異性抗體,如抗人IL-6單克隆抗體); 間接法:包被純化抗原(如乙肝表面抗原 HBsAg,用于檢測樣本中的抗 HBsAg 抗體); 競爭法:可能包被抗原或抗體,根據設計邏輯調整。 |
| 檢測抗體 | 與靶標(已被包被分子捕獲)結合,連接酶標記 | 雙抗體夾心法:酶標記檢測抗體(直接標記HRP/AP的特異性抗體,如HRP-抗人 IL-6多克隆抗體); 間接法:未標記檢測抗體(二抗,如羊抗人 IgG 抗體,需后續結合酶標二抗); 部分試劑盒會將 “檢測抗體” 與 “酶” 分開提供(需用戶自行偶聯,較少見)。 |
二、酶標記相關試劑:實現 “信號轉換與放大”
酶是ELISA 的 “信號發生器”,通過催化底物產生可見信號(顏色、熒光等),需配套酶的 “載體”(酶標二抗)和 “底物系統”。
| 試劑類型 | 核心功能 | 常見形式與說明 |
| 酶標二抗 | 結合未標記的檢測抗體,攜帶酶分子 | 僅間接法或捕獲法中需用到,如HRP標記羊抗人IgG、AP標記兔抗鼠IgG;需與檢測抗體的種屬、亞型匹配(如檢測抗體為鼠源IgG,酶標二抗需針對 “鼠 IgG”)。 |
| 酶底物溶液 | 被酶催化產生可檢測信號(顏色為主) | 最常用酶:辣根過氧化物酶(HRP) 和堿性磷酸酶(AP),對應底物不同: 1. HRP底物:TMB(3,3',5,5'- 四甲基聯苯胺,顯色為藍色,終止后變黃)、OPD(鄰苯二胺,顯色為橙黃色,需避光); 2. AP 底物:pNPP(對硝基苯磷酸酯,顯色為黃色)、BCIP/NBT(顯色為藍紫色,用于膜 ELISA)。 |
| 終止液 | 終止酶促反應,固定信號(避免信號持續增強) | HRP-TMB系統:常用2M H?SO?(硫酸),終止后顏色從藍變穩定的黃色; AP-pNPP系統:常用0.5M NaOH(氫氧化鈉),終止后黃色穩定; 注意:終止液多為強酸/強堿,需避免接觸皮膚。 |
三、校準品(標準品):實現 “定量/定性參考”
校準品是確定樣本中靶標濃度(或陽性判定)的 “標尺”,必須經過嚴格的純度和濃度標定。
| 類型 | 核心功能 | 常見形式與說明 |
| 標準品(校準品) | 繪制標準曲線,計算樣本中靶標濃度 | 通常為5-7個梯度濃度的純化靶標(如重組人 IL-6、純化 HBsAg); 濃度范圍覆蓋試劑盒的 “檢測限(LOD)” 到 “上限(ULOQ)”,確保樣本濃度落在曲線線性范圍內; 部分定性試劑盒(如新冠抗體檢測)可能僅提供 “陽性對照” 和 “陰性對照”,替代梯度標準品。 |
四、質控品:監控 “實驗有效性”
質控品用于驗證實驗過程是否合格(如試劑失效、操作誤差),避免錯誤結果,通常分為 “陽性質控” 和 “陰性質控”。
| 類型 | 核心功能 | 常見形式與說明 |
| 陽性質控品(PC) | 驗證 “檢測系統能否有效檢出陽性樣本” | 含已知濃度的靶標(濃度通常在標準曲線中間范圍,如100pg/mL的IL-6),實驗后需落在預設的 “合格濃度區間”,否則實驗無效。 |
| 陰性質控品(NC) | 驗證 “檢測系統是否存在非特異性結合(假陽性)” | 不含靶標的基質(如無IL-6的人血清、PBS緩沖液),實驗后信號值需低于 “陽性判定閾值(Cut-off)”,否則提示污染或非特異性結合。 |
| 空白質控(Blank) | 排除 “試劑本身的背景信號” | 僅加緩沖液和底物(不加任何抗體/抗原),用于校正酶標儀的背景讀數,確保信號僅來自靶標結合的酶反應。 |
五、洗滌液:去除 “非特異性結合物”
ELISA 反應中會產生大量未結合的抗體、酶標試劑等,需通過洗滌去除,避免背景信號過高(假陽性),洗滌液的核心是 “緩沖液 + 表面活性劑”。
| 試劑類型 | 核心功能 | 常見形式與說明 |
| 濃縮洗滌液 | 稀釋后用于清洗酶標板,去除未結合物 | 基礎成分:PBS(磷酸鹽緩沖液) 或Tris-HCl緩沖液(維持 pH穩定); 關鍵添加劑:0.05% Tween-20(非離子表面活性劑,減少非特異性吸附); 試劑盒通常提供10× 或 20× 濃縮液,需用戶用去離子水稀釋后使用(稀釋比例需嚴格遵循說明書,否則影響洗滌效果)。 |
六、樣本稀釋液/封閉液:優化 “反應環境”
這類試劑用于改善樣本兼容性、減少非特異性結合,確保反應高效進行。
| 試劑類型 | 核心功能 | 常見形式與說明 |
| 樣本稀釋液 | 稀釋高濃度樣本、降低基質干擾 | 成分:含BSA牛血清白蛋白、吐溫-20的緩沖液; 作用:1.稀釋超過檢測上限的樣本(如1000pg/mL的IL-6需稀釋10倍后檢測); 2.封閉樣本中的干擾物質(如血清中的補體、蛋白酶); 3.維持抗體活性。 |
| 封閉液 | 封閉酶標板孔內未結合包被分子的 “空白位點” | 常見成分:5% BSA、1%脫脂奶粉或封閉肽(針對特異性位點); 作用:避免后續抗體/酶標試劑非特異性結合到板孔表面,降低背景信號(若省略封閉步驟,可能出現高背景或假陽性); 注:部分試劑盒已將封閉液預包被在酶標板中(即 “預封閉板”),無需用戶額外添加。 |
七、不同 ELISA 類型的組分差異總結
| ELISA 類型 | 核心差異(特異性結合試劑) | 適用場景 |
| 雙抗體夾心法 | 包被抗體+酶標檢測抗體(直接針對抗原) | 檢測大分子抗原(如IL-6、腫瘤標志物CEA) |
| 間接法 | 包被抗原+未標記一抗+酶標二抗 | 檢測抗體(如乙肝抗體、新冠IgG抗體) |
| 競爭法 | 包被抗原+酶標抗原(或包被抗體 + 酶標抗體) | 檢測小分子抗原(如激素、藥物)或樣本中干擾物質多的場景 |
ELISA試劑盒的組分設計圍繞 “特異性結合-信號放大-結果校準-質量控制” 展開,不同類型的核心差異僅在于 “特異性結合試劑” 的組合,其他基礎組分(酶底物、洗滌液、質控品)高度通用。使用時需嚴格遵循說明書,尤其是試劑稀釋比例、孵育時間和溫度,以確保結果準確性。






