純化重組蛋白時,若出現目標蛋白與雜蛋白分子量接近的情況,除了親和層析,還可結合哪些層析技術(如離子交換層析、疏水相互作用層析)進行分
日期:2025-09-24 17:01:44
在純化重組蛋白時,若目標蛋白與雜蛋白分子量接近(親和層析難以完全分離),可根據兩者在電荷、疏水性、等電點、分子構象等理化性質的差異,結合以下層析技術實現有效分離,核心思路是利用非分子量相關的特性差異構建分離條件:
一、核心可結合的層析技術及分離原理
一、核心可結合的層析技術及分離原理
1. 離子交換層析(Ion Exchange Chromatography, IEC)
分離核心:基于目標蛋白與雜蛋白表面凈電荷差異(如羧基、氨基數量不同),在特定 pH 緩沖液中與離子交換樹脂(帶正電/負電)的結合能力不同,通過改變緩沖液鹽濃度(如NaCl梯度)洗脫,實現分離。
適用場景:當目標蛋白與雜蛋白等電點(pI)差異≥0.5 時,分離效果顯著。
例:若目標蛋白pI=7.5(中性偏堿,酸性條件下帶正電),雜蛋白 pI=5.0(酸性,酸性條件下帶負電),可選用陽離子交換樹脂(如SP Sepharose),在 pH=6.0 的緩沖液中,目標蛋白結合樹脂,雜蛋白直接流穿,再用高鹽洗脫目標蛋白。
2. 疏水相互作用層析(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)
分離核心:基于目標蛋白與雜蛋白表面疏水性氨基酸殘基暴露程度差異,在高鹽緩沖液中,疏水性強的蛋白與HIC樹脂(如苯基、辛基修飾)結合更緊密,通過降低鹽濃度(如硫酸銨梯度降低),使疏水性弱的蛋白先洗脫,實現分離。
適用場景:兩者分子量接近但疏水性差異大(如目標蛋白含較多疏水結構域,雜蛋白為親水性蛋白),或經鹽析沉淀后需進一步純化時。
例:純化抗體片段時,若目標片段疏水性高于雜蛋白,可在 2M 硫酸銨緩沖液中上樣至苯基瓊脂糖樹脂,雜蛋白因疏水性弱先流穿,目標片段則需用 0.5M 硫酸銨緩沖液洗脫。
3. 等電聚焦層析(Isoelectric Focusing Chromatography, IEF)
分離核心:利用兩性電解質形成pH 梯度,目標蛋白與雜蛋白會遷移至自身pI對應的pH區域(此處凈電荷為0,停止遷移),通過收集不同 pH 區間的組分實現分離。
優勢:分辨率極高,可區分 pI 差異僅0.1-0.2的蛋白,適合分子量接近但 pI 差異明確的場景;但操作較復雜,需專用設備(如 IEF 柱),且不適合大規模制備(更常用于分析或小規模純化)。
4. 羥基磷灰石層析(Hydroxyapatite Chromatography, HAC)
分離核心:基于蛋白與羥基磷灰石(Ca??(PO?)?(OH)?)樹脂的雙重作用:一是蛋白表面羧基與樹脂中 Ca²?的靜電結合,二是蛋白氨基與樹脂中 PO?³?的親和作用,通過改變磷酸緩沖液濃度(如 0.01-0.5M Na?HPO?梯度),調節結合強度實現分離。
適用場景:當離子交換層析無法區分(如 pI 接近),但蛋白表面羧基 / 氨基分布差異大時(如目標蛋白含較多磷酸化位點,與 Ca²?結合更強),HAC 可作為補充手段,尤其適合抗體、酶類蛋白的精細純化。

二、關鍵操作注意事項(通用原則)
前處理適配:
上樣前需確保樣品與層析緩沖液pH、鹽濃度一致(如 IEC 需調節樣品 pH 至樹脂適用范圍,HAC 需用低濃度磷酸緩沖液平衡),避免因條件突變導致蛋白沉淀或非特異性結合。
樣品需離心(12000rpm, 10min)或過濾(0.22μm 膜),去除雜質,防止堵塞層析柱。
梯度洗脫優化:
避免使用 “陡梯度”(如鹽濃度驟升),優先采用線性梯度洗脫(如IEC中NaCl從0.1M緩慢升至 1M,持續20-30個柱體積),可更清晰地分開目標蛋白與雜蛋白的洗脫峰,減少交叉污染。
與親和層析的銜接:
通常建議先進行 “粗純化”(如離子交換層析去除大部分雜蛋白),再用親和層析(如 His-tag、GST-tag)捕獲目標蛋白,最后用HIC或IEF進行 “精細純化”,形成 “多步層析組合”,最大化提高純度(純度可達95%以上)。
當目標蛋白與雜蛋白分子量接近時,核心是通過 “電荷、疏水性、pI” 等特性差異選擇層析技術,實際應用中常需2-3種技術組合(如 “離子交換 + 疏水相互作用”),并結合緩沖液條件優化,實現高效分離。






