蛋白表達(dá)純化過程中，會(huì)通過哪些指標(biāo)評(píng)估蛋白質(zhì)量（如純度、活性、分子量、穩(wěn)定性等），檢測(cè)方法分別是什么？
日期：2025-09-18 16:09:14
在蛋白表達(dá)純化過程中，蛋白質(zhì)量的評(píng)估是確保其后續(xù)應(yīng)用（如結(jié)構(gòu)解析、功能研究、藥物開發(fā)、診斷試劑制備等）可靠性的核心環(huán)節(jié)。評(píng)估指標(biāo)需覆蓋純度、活性、分子量、穩(wěn)定性、完整性、濃度、均一性等多個(gè)維度，不同指標(biāo)對(duì)應(yīng)多種成熟的檢測(cè)方法。以下是詳細(xì)分類及說明：
2. 活性（Activity）：衡量蛋白生物學(xué)功能的完整性
3. 分子量（Molecular Weight, MW）：驗(yàn)證目標(biāo)蛋白的正確性（避免降解 / 聚集）
4. 穩(wěn)定性（Stability）：衡量蛋白在儲(chǔ)存 / 實(shí)驗(yàn)條件下的保持能力
5. 其他關(guān)鍵指標(biāo)
二、指標(biāo)選擇策略：根據(jù)蛋白應(yīng)用場(chǎng)景側(cè)重
一、核心評(píng)估指標(biāo)及對(duì)應(yīng)檢測(cè)方法
1. 純度（Purity）：衡量目標(biāo)蛋白中雜蛋白的含量
純度是蛋白質(zhì)量的基礎(chǔ)指標(biāo)，直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性（如避免雜蛋白干擾活性檢測(cè)）。
| 檢測(cè)方法 | 原理 | 優(yōu)勢(shì) | 局限性/適用場(chǎng)景 |
| SDSPAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳） | 蛋白在變性條件下（SDS+巰基乙醇）按分子量分離，通過考馬斯亮藍(lán)/銀染顯色，目標(biāo)蛋白條帶占總條帶的比例即為純度（半定量）。 | 操作簡(jiǎn)單、成本低、直觀 可同時(shí)初步判斷分子量 |
半定量（誤差±10%） 無法區(qū)分分子量相近的雜蛋白 |
| HPLC（高效液相色譜）反相/離子交換 | 基于蛋白疏水性（反相）或電荷（離子交換）差異，通過色譜柱分離，主峰面積占比即為純度（定量）。 | 高分辨率、準(zhǔn)確定量（誤差±2%） 可檢測(cè)微量雜蛋白（<0.1%） |
成本較高 反相HPLC需有機(jī)相，可能影響蛋白活性 |
| 考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）結(jié)合超濾 | 先通過超濾分離目標(biāo)蛋白與小分子雜質(zhì)，再用Bradford法測(cè)定總蛋白與目標(biāo)蛋白濃度，計(jì)算純度。 | 適用于去除小分子雜質(zhì)后的純度評(píng)估 | 無法區(qū)分大分子雜蛋白（如其他球蛋白） |
| WesternBlot（免疫印跡） | 用特異性抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白，通過條帶有無/強(qiáng)度判斷雜蛋白是否存在（定性/半定量）。 | 極高特異性（僅識(shí)別目標(biāo)蛋白） | 半定量 無法檢測(cè)抗體不識(shí)別的雜蛋白 |
2. 活性（Activity）：衡量蛋白生物學(xué)功能的完整性
活性是功能性蛋白（如酶、抗體、受體）的核心指標(biāo)，需根據(jù)蛋白類型選擇針對(duì)性方法。
| 蛋白類型 | 檢測(cè)方法 | 原理 | 示例 |
| 酶類蛋白 | 底物顯色法/熒光法 | 利用酶對(duì)特異性底物的催化作用，通過吸光度/熒光強(qiáng)度變化計(jì)算酶活（單位：U/mg）。 | 蛋白酶：檢測(cè)酪蛋白降解后釋放的氨基酸（福林酚法） 激酶：檢測(cè)ATP磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物的量（放射性同位素法） |
| 抗體類蛋白 | ELISA（酶聯(lián)免疫吸附法） | 用抗原包被板，加入抗體后通過酶標(biāo)二抗顯色，計(jì)算抗體結(jié)合活性（EC50值）。 | 單克隆抗體：檢測(cè)與腫瘤抗原（如Her2）的結(jié)合能力 |
| 受體類蛋白 | 配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（BLI/SPR） | 用生物層干涉技術(shù)（BLI）或表面等離子體共振（SPR），實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)受體與配體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)（親和力KD值）。 | G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）：檢測(cè)與小分子配體的結(jié)合速率與解離速率 |
| 結(jié)構(gòu)蛋白（如膜蛋白） | 功能性整合實(shí)驗(yàn) | 檢測(cè)蛋白是否能正確組裝到膜上并維持結(jié)構(gòu)功能（如離子通道的電生理活性）。 | 離子通道蛋白：通過膜片鉗技術(shù)檢測(cè)離子通透性 |
3. 分子量（Molecular Weight, MW）：驗(yàn)證目標(biāo)蛋白的正確性（避免降解 / 聚集）
| 檢測(cè)方法 | 原理 | 優(yōu)勢(shì) | 局限性 |
| SDSPAGE（還原/非還原條件） | 還原條件（加巰基乙醇）：斷裂二硫鍵，檢測(cè)單體分子量； 非還原條件：保持蛋白天然聚合狀態(tài)，檢測(cè)寡聚體分子量。 |
快速、直觀、成本低 | 誤差較大（±5%10%），需結(jié)合蛋白Marker對(duì)比 |
| 質(zhì)譜（MALDITOF/ESIMS） | 蛋白離子化后，根據(jù)質(zhì)荷比（m/z）計(jì)算精確分子量。 | 極高精度（誤差<0.1%） 可同時(shí)檢測(cè)翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化） |
成本高 無法檢測(cè)大分子量聚合體（>200kDa，ESIMS除外） |
| 凝膠過濾色譜（GFC/SEC） | 蛋白按Stokes半徑（與分子量正相關(guān)）通過凝膠柱，與標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白對(duì)比，計(jì)算表觀分子量。 | 可同時(shí)分析蛋白聚集狀態(tài)（如單體/二聚體） | 表觀分子量受蛋白形狀影響（如纖維蛋白與球形蛋白結(jié)果差異大） |
4. 穩(wěn)定性（Stability）：衡量蛋白在儲(chǔ)存 / 實(shí)驗(yàn)條件下的保持能力
穩(wěn)定性決定蛋白的儲(chǔ)存周期和應(yīng)用場(chǎng)景（如是否適合長(zhǎng)期冷凍、室溫操作）。
| 檢測(cè)維度 | 檢測(cè)方法 | 原理 | 評(píng)估指標(biāo) |
| 熱穩(wěn)定性 | 差示掃描量熱法（DSC） | 監(jiān)測(cè)蛋白隨溫度升高的熱變性過程，記錄變性溫度（Tm值）。 | Tm值越高，熱穩(wěn)定性越強(qiáng)（如抗體Tm>65℃為合格） |
| 儲(chǔ)存穩(wěn)定性 | 加速穩(wěn)定性試驗(yàn) | 在不同條件（4℃/25℃/37℃、pH5.08.0、高鹽/低鹽）下儲(chǔ)存，定期檢測(cè)純度、活性、聚集率。 | 4℃儲(chǔ)存3個(gè)月，活性保留率>90%為合格 |
| 聚集穩(wěn)定性 | 動(dòng)態(tài)光散射（DLS） | 檢測(cè)蛋白顆粒的hydrodynamicradius，計(jì)算聚集率（多分散指數(shù)PDI）。 | PDI<0.2為單分散（無聚集），PDI>0.5為嚴(yán)重聚集 |
| 化學(xué)穩(wěn)定性 | 圓二色譜（CD） | 檢測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（α螺旋、β折疊）的變化，反映化學(xué)變性劑（如尿素、胍鹽）對(duì)結(jié)構(gòu)的影響。 | 二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化<10%為穩(wěn)定 |
5. 其他關(guān)鍵指標(biāo)
| 指標(biāo) | 檢測(cè)目的 | 常用方法 |
| 完整性（Integrity） | 驗(yàn)證蛋白是否存在降解、斷裂或錯(cuò)誤剪切 | WesternBlot（檢測(cè)是否有降解片段） 質(zhì)譜（分析序列覆蓋度，需100%覆蓋目標(biāo)序列） N/C端測(cè)序（確認(rèn)兩端氨基酸是否正確） |
| 濃度（Concentration） | 定量蛋白量，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如活性檢測(cè)、結(jié)晶） | BCA法（適用于所有蛋白，抗干擾能力強(qiáng)） Bradford法（適用于球形蛋白，受去污劑干擾） UV280法（利用色氨酸/酪氨酸的紫外吸收，快速但受核酸干擾） |
| 均一性（Homogeneity） | 驗(yàn)證蛋白是否為單一構(gòu)象/聚合狀態(tài) | 凝膠過濾色譜（GFC）：?jiǎn)我恢鞣鍨榫?br />
動(dòng)態(tài)光散射（DLS）：PDI<0.2 分析型超速離心（AUC）：?jiǎn)我怀两捣?/span> |
| 翻譯后修飾（PTM） | 檢測(cè)糖基化、磷酸化等修飾（影響活性/穩(wěn)定性） | 質(zhì)譜（MALDITOF/ESIMS，精準(zhǔn)鑒定修飾位點(diǎn)） 糖電泳（檢測(cè)糖基化水平） 磷酸酶處理結(jié)合SDSPAGE（驗(yàn)證磷酸化） |
二、指標(biāo)選擇策略：根據(jù)蛋白應(yīng)用場(chǎng)景側(cè)重
不同研究目標(biāo)對(duì)蛋白質(zhì)量的要求差異較大，需針對(duì)性選擇核心指標(biāo)：
結(jié)構(gòu)解析（如 X 射線晶體學(xué)）：優(yōu)先關(guān)注 純度（>95%）、均一性（PDI<0.15）、完整性（無降解），活性可次要（部分結(jié)構(gòu)研究需蛋白保持天然構(gòu)象）。
功能研究（如酶動(dòng)力學(xué)、信號(hào)通路）：核心是 活性（需準(zhǔn)確定量），同時(shí)要求純度 > 90%（避免雜蛋白干擾）、穩(wěn)定性（確保實(shí)驗(yàn)重復(fù)性）。
藥物開發(fā)（如抗體藥）：需全面評(píng)估，包括 純度（>99%）、活性（KD 值 / EC50 值）、穩(wěn)定性（Tm>60℃，4℃儲(chǔ)存 6 個(gè)月活性保留 > 85%）、低聚集率（<1%），且需符合 GMP 級(jí)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。
診斷試劑（如抗原檢測(cè)試劑盒）：側(cè)重 特異性（Western Blot 驗(yàn)證無交叉反應(yīng)）、穩(wěn)定性（室溫儲(chǔ)存 12 個(gè)月活性不變）、均一性（批間差異 < 5%）。
蛋白質(zhì)量評(píng)估需形成 “多指標(biāo)組合” 體系，而非單一方法判定。例如：
對(duì)于重組酶蛋白，需通過 SDS-PAGE（初篩純度）+ HPLC（精確定量純度）+ 底物顯色法（活性）+ DLS（聚集率）+ DSC（熱穩(wěn)定性） 全面驗(yàn)證；
對(duì)于單克隆抗體，需通過 HPLC（純度 > 99%）+ ELISA（結(jié)合活性）+ GFC（聚集率 < 1%）+ 加速穩(wěn)定性試驗(yàn)（4℃儲(chǔ)存 6 個(gè)月）+ 質(zhì)譜（糖基化修飾） 評(píng)估。
最終需根據(jù)蛋白的 “應(yīng)用目標(biāo)” 和 “特性”（如分子量、是否含二硫鍵、是否易聚集），靈活選擇最適合的檢測(cè)方法組合。
