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昆蟲細胞表達蛋白流程是什么?

日期:2024-09-03 10:57:37

昆蟲細胞表達蛋白質的流程主要包括以下幾個步驟:
 
1. 構建表達載體
    選擇載體:選擇適合昆蟲細胞的表達載體,如pFastBac或 pAc5.1。
    插入基因:將目標蛋白質編碼基因插入到表達載體中,通常使用限制酶切割和連接酶連接技術。
 
2. 轉化和制備質粒
    轉化大腸桿菌:將重組表達載體轉化到大腸桿菌中進行擴增。常用的方法包括熱激法或電轉法。
    質粒提取:從大腸桿菌中提取重組質粒,進行純化。
 
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3. 轉染昆蟲細胞
    選擇細胞系:常用的昆蟲細胞系包括Sf9(Spodoptera frugiperda)和High Five™(Trichoplusia ni)。
    轉染方法:使用病毒介導的轉染(如Baculovirus)或化學方法(如聚乙烯亞胺)將重組質粒轉染入昆蟲細胞。
 
4. 病毒生產與擴增(如果使用Baculovirus系統)
    病毒包裝:將重組質粒與昆蟲細胞共轉染到包裝細胞中(如Sf9),生產重組Baculovirus。
    病毒收獲:從包裝細胞的培養基中收獲病毒液體。
 
5. 感染昆蟲細胞
    感染細胞:將重組Baculovirus感染到昆蟲細胞中,促使細胞表達目標蛋白質。
培養:在適當的條件下(如溫度和培養基)培養感染的昆蟲細胞。
 
6. 蛋白質表達與收獲
    監測表達:通過檢測表達水平(如Western Blot、ELISA)來確認蛋白質的表達。
    收獲細胞:通常在細胞生長到對數期后進行收獲。細胞可以通過離心收集或直接從培養基中提取蛋白質。
 
7. 蛋白質純化
    裂解細胞:使用超聲波破碎、化學裂解劑或其他方法裂解細胞,釋放目標蛋白質。
    純化方法:根據蛋白質的性質,使用親和層析、離子交換層析、尺寸排阻層析等方法進行純化。
    蛋白質檢測:對純化后的蛋白質進行分析,如SDS-PAGE、質譜等,確認其純度和結構。
 
8. 蛋白質分析與應用
    功能測試:評估蛋白質的生物活性和功能。
    保存與儲存:將純化的蛋白質儲存于適當的條件下(如低溫)以備后續使用。
 
    以上流程概述了昆蟲細胞表達系統的主要步驟。具體的操作細節可能會根據實驗要求和使用的細胞系或表達系統有所不同。