酵母三雜交技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理

日期：2023-07-13 16:13:57

酵母三雜交技術(shù)（yeast three-hybrid, Y3H）是常用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。它基于酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活因子（transcriptional activator）的特性，通過檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)的相互作用來篩選相互作用伴侶。

以下是酵母三雜交技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理步驟：

構(gòu)建酵母菌株：

構(gòu)建一個(gè)酵母菌株，其中包含兩個(gè)可表達(dá)靶蛋白（target protein）和激活域（activation domain）的融合蛋白。這些融合蛋白通過基因工程方法將其編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)元件結(jié)合在一起。

酵母菌株中也含有一個(gè)報(bào)告基因（reporter gene），它的啟動(dòng)子區(qū)域包含識(shí)別序列（binding site）。這個(gè)識(shí)別序列可以被激活域識(shí)別并結(jié)合。

共表達(dá)被檢測(cè)蛋白與靶蛋白：

引入第三個(gè)外源基因，這個(gè)基因編碼一個(gè)與被檢測(cè)蛋白（bait protein）相互作用的蛋白質(zhì)（prey protein）。這個(gè)蛋白質(zhì)會(huì)與靶蛋白形成復(fù)合物。

靶蛋白和激活域的融合蛋白同時(shí)表達(dá)，形成復(fù)合物。

檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)：

如果被檢測(cè)蛋白與靶蛋白相互作用，它們會(huì)結(jié)合并促使激活域與識(shí)別序列結(jié)合，從而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

報(bào)告基因可以是編碼可觀察性標(biāo)記物的基因，如熒光蛋白基因，或者編碼對(duì)酵母細(xì)胞存活有影響的基因。

結(jié)果分析：

觀察報(bào)告基因的表達(dá)情況，如果報(bào)告基因表達(dá)增加，則說明被檢測(cè)蛋白與靶蛋白發(fā)生相互作用。