如何對包涵體蛋白進行表達與復性?

日期：2023-06-06 13:41:30

包涵體蛋白表達與復性的過程中，需要進行以下步驟：

一、基因克隆

1、選擇適當的質粒載體

常見的質粒載體有pET系列、pGEX系列等。根據需要選擇含有不同誘導子和選擇標記的質粒載體。

2、擴增目的基因

將目的基因擴增后，將其接入到質粒載體的多克隆位點上。這一步可以通過PCR方法來進行擴增，也可以通過化學合成的方式獲取到序列完整、長度合適的基因片段。同時，在PCR擴增過程中，應考慮到靶基因的大小和構建的質粒載體的限制酶切位點的配對問題。

3、活性測定

在將目的基因接到質粒載體后，可進行限制性酶切鑒定、DNA測序鑒定等活性測定，以確定目的基因序列是否正確。

二、轉化

將質粒載體轉化入大腸桿菌中，使其在細菌內表達。轉化方法有化學轉化法、電轉化法和熱激轉化法等。

三、篩選陽性克隆株

轉化后需要對大腸桿菌進行篩選。常用的方法是在含有抗生素的LB平板上篩選，含有適合質粒載體選擇標記的抗生素（如氨芐青霉素、卡那霉素）。

四、包涵體蛋白表達

1、預培養

將大腸桿菌陽性克隆株接入到LB培養基中預培養，通常為37℃、200-250rpm振蕩培養。

2、誘導表達

當大腸桿菌發展到指定的OD600值時，添加誘導劑進行表達。在此過程中應選擇合適的誘導濃度和時間，不同的質粒載體可能對誘導劑的反應存在差異。

3、加入輔酶

輔酶對于某些蛋白質表達至關重要。如在pET質粒中，可以添加輔酶T7。

4、分析表達

通過采集樣品、離心、液氮凍存等方法來分析蛋白表達的情況，如采用SDS-PAGE技術進行蛋白質分離，并采用Western blotting技術進行檢測。

五、包涵體蛋白復性

1、包涵體蛋白的裂解

將表達的細菌分裝至每個離心管中，采用超聲波、熱激或流體剪切的方法進行細胞裂解。對于不同類型的包涵體蛋白，應選擇不同的裂解方式和時間。

2、去除雜質

將細胞裂解物經過離心去除細胞碎片等雜質，得到含有包涵體的上清液。

3、包涵體蛋白的再溶解

使用緩沖液將包涵體溶解后，使用Refolding Buffer進行復性。Refolding Buffer通常包括還原劑如DTT等，以促進蛋白的還原和復性。

4、蛋白純化

復性過程完成后，使用親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等方法來純化復性的蛋白質。

通過以上步驟，可以較為可靠地實現包涵體蛋白表達與復性，并進一步開展相關實驗研究。