怎么減少大腸桿菌表達產物中的內毒素污染？
日期：2025-06-16 13:52:56
在大腸桿菌重組蛋白表達中，內毒素（脂多糖 LPS）污染是影響產物安全性的關鍵問題，尤其在生物醫藥領域（如重組蛋白藥物、疫苗）中需嚴格控制（通常要求 < 0.1 EU/mg 蛋白）。以下從全流程控制策略出發，提供系統性解決方案：
一、上游階段：菌株與培養體系優化
（1）菌株改造與篩選
選用 LPS 缺陷型菌株：
K12 衍生株：如 JM109、DH5α，缺乏 O 抗原多糖鏈，內毒素免疫原性降低。
深度基因改造菌株：如 ΔlpxM 突變株，缺失脂 A 合成關鍵酶，減少內毒素毒性核心結構生成。
共表達內毒素結合蛋白：如表達人脂多糖結合蛋白（LBP），在胞內中和內毒素。
（2）培養基與培養工藝優化
無動物源培養基：避免使用酵母提取物、蛋白胨等可能含外源性內毒素的成分，改用化學限定培養基（如 M9 培養基）。
控制細胞裂解時機：
避免培養過度（OD600>5.0），防止細胞自溶釋放內毒素，可通過流加培養維持對數生長期。
誘導階段添加滲透壓保護劑（如 10% 蔗糖），增強細胞膜穩定性。
溫度與 pH 調控：低溫（25-30℃）培養可降低 LPS 合成相關基因（如 lpxC）的表達，維持 pH 7.0-7.5 減少細胞裂解。
二、中游階段：裂解與粗純工藝控制
（1）細胞裂解策略
溫和裂解優先：
酶解法：用溶菌酶（1-5 mg/mL）+ 滲透壓沖擊（0.5 M 蔗糖→水），減少 LPS 從細胞壁脫落。
高壓均質破碎：相比超聲破碎，可降低 30-50% 的 LPS 釋放量（超聲的空化效應易破壞細胞壁完整性）。
裂解液添加抑制劑：
加入 EDTA（5-10 mM）螯合 Ca²+/Mg²+，破壞 LPS 分子間聚集，減少與蛋白的非特異性結合。
用脫氧膽酸鈉（0.1-0.5%）選擇性溶解 LPS，同時保持蛋白可溶性。
（2）粗純階段初步除內毒素
離心與過濾優化：
高速離心（15,000×g）沉淀包涵體時，上清液用 0.22 μm 膜過濾，去除細胞碎片攜帶的 LPS。
親和層析捕獲蛋白時，用含 0.5 M NaCl 的平衡液洗脫，減少 LPS 非特異性吸附。
三、下游階段：純化與精制技術
（1）層析法高效除內毒素
陰離子交換層析（AEX）：
原理：LPS 帶負電荷（pI 3-4），在中性 pH 下與陰離子交換樹脂（如 Q Sepharose）結合，而多數蛋白 pI>5 可穿透。
操作：上樣緩沖液 pH 7.5-8.0，用 0.1-1 M NaCl 梯度洗脫，內毒素在高鹽段洗脫，蛋白提前收集。
效果：單次層析可去除 90% 以上內毒素，結合動態載量控制（<50% 飽和載量）效果更佳。
親和層析吸附：
多粘菌素 B 親和柱：利用多粘菌素 B 與 LPS 脂 A 的高親和力（Kd~10?? M），特異性吸附內毒素。
操作：將蛋白溶液通過多粘菌素 B 瓊脂糖柱，流速 1-2 mL/min，柱床體積 1-5%，內毒素去除率可達 99%。
注意：適用于中性或偏堿性蛋白（pH 7.0-8.5），酸性條件下多粘菌素 B 與 LPS 結合力下降。
疏水相互作用層析（HIC）：
原理：LPS 的脂類部分具疏水性，在高鹽條件下與疏水樹脂（如 Phenyl Sepharose）結合，蛋白在低鹽條件洗脫。
應用：與 AEX 聯用，可進一步降低內毒素至 < 0.01 EU/mg。
（2）去污劑相分離法
Triton X-114 相分離：
操作：
蛋白溶液中加入 1-2% Triton X-114，4℃平衡 30 分鐘。
升溫至 37℃，LPS 與去污劑形成濁相，離心（10,000×g，10 分鐘）后收集水相蛋白。
效果：內毒素去除率 60-80%，適用于膜蛋白或疏水蛋白體系。
（3）超濾與化學處理
超濾分級：使用 10-30 kDa 截留分子量的膜，通過切向流過濾（TFF）去除游離 LPS（分子量～10-100 kDa），同時換液降低內毒素濃度。
化學滅活：
過氧乙酸（0.05-0.1%）處理 30 分鐘，破壞 LPS 的脂 A 結構，適用于終產品滅活，但需注意殘留檢測。
酸 / 堿處理（如 pH 2.0 處理 2 小時或 pH 11.0 處理 1 小時），降解 LPS 的多糖鏈，但需驗證蛋白穩定性。
四、全流程污染控制與檢測
（1）操作規范
無內毒素環境控制：
所有試劑用內毒素 - free 水配制（如超純水經 180℃干熱 4 小時或活性炭吸附處理）。
耗材使用預認證的無內毒素產品（如 Nalgene 離心管、Millipore 濾膜），玻璃器皿經 250℃干熱 4 小時滅活內毒素。
人員防護：操作人員穿戴無塵服，避免皮膚接觸試劑，實驗臺面用 70% 乙醇 + 0.1% SDS 擦拭。
（2）內毒素檢測方法
鱟試劑法（LAL 法）：
動態濁度法：檢測限 0.005 EU/mL，適用于過程監控。
顯色基質法：定量范圍 0.01-10 EU/mL，用于終產品放行檢測。
重組 C 因子法（rFC 法）：
利用重組鱟 C 因子與 LPS 的特異性反應，檢測限 0.001 EU/mL，無鱟試劑批次差異，已被《中國藥典》2025 版收錄。
五、工藝優化案例
重組干擾素 α 的內毒素控制：
采用 BL21 (DE3) ΔlpxM 菌株，搖瓶培養 OD600 控制在 3.0 時誘導。
高壓均質破碎（1500 bar），裂解液加 10 mM EDTA。
先經 Q Sepharose AEX（NaCl 梯度 0-0.5 M），再通過多粘菌素 B 柱（流速 1.5 mL/min）。
最終產物內毒素 <0.05 EU/mg，收率> 80%。
新冠刺突蛋白亞單位疫苗：
采用 “層析 + 超濾” 組合工藝：
陰離子交換（Capto Q）→ 多粘菌素 B 親和 → 30 kDa 超濾換液。
內毒素從初始 1000 EU/mg 降至 < 0.1 EU/mg，符合 WHO 疫苗標準。
六、關鍵注意事項
方法兼容性：需評估除內毒素方法對蛋白活性的影響，如多粘菌素 B 可能與帶正電蛋白結合，需優化上樣 pH。
組合策略優先：單一方法難以達到生物醫藥級標準（<0.1 EU/mg），建議采用 “層析 + 親和 + 超濾” 三級工藝。
過程監控：在裂解液、粗純樣品、精純樣品各階段檢測內毒素，定位污染節點并優化。
通過從菌株改造、培養工藝到純化技術的全流程控制，結合先進檢測手段，可將大腸桿菌表達產物的內毒素水平降至安全閾值以下，滿足臨床應用需求。
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