酵母雙雜交篩選互作蛋白流程

日期：2023-05-29 16:31:20

酵母雙雜交技術是一種常用的蛋白質互作篩選方法，通過利用酵母中的轉錄因子結合域（BD）和激活域（AD）相互作用來檢測目標蛋白在細胞內是否存在互作關系。這項技術可以用于從大量的蛋白質庫中篩選出與已知蛋白質相互作用的候選分子。下面將介紹酵母雙雜交篩選互作蛋白的流程。

一、克隆兩個DNA片段

首先需克隆兩個DNA片段：一個用于編碼轉錄因子結合域BD，另一個用于編碼激活域AD。這兩個DNA片段需分別克隆到不同的表達載體中。其中，BD和AD的序列應該很短，這有助于減少錯配結合和非特異性激活的可能性。此外，在選擇BD和AD的序列時要避免它們之間的重疊區。BD和AD序列應該還需要經過驗證，以確保它們不對細胞造成毒性影響。

二、將兩個表達載體引入酵母細胞

將BD載體和AD載體分別轉化到酵母細胞中，然后進行培養。要確保轉化效率、酵母細胞健康狀態和表達載體的穩定性。

三、篩選蛋白質相互作用

將需要篩選的蛋白質庫與轉化后的酵母菌涂在含有選擇素的富含糖的平板上。這些平板上的細胞將生長出許多小白色斑點，這些斑點代表可能存在蛋白質互作的情況。待這些小斑點變大之后，將它們收集到小管中，并進行PCR擴增，以確定它們的DNA序列。可在獲得的DNA序列數據庫中搜索匹配的蛋白資料庫，查看其是否已知與目標蛋白有互作關系。

此外，在酵母雙雜交中還需注意以下事項：

1、轉化后的酵母細胞應該是健康狀態的，并且表達載體應該是穩定的。

2、選擇合適的蛋白質庫，以確保它包含感興趣的蛋白質。通常，可以采用人類或其它模式生物的基因庫。

3、在初始篩選時，應該使用嚴格的選擇條件，以排除非特異性的互作。

4、在一些情況下，可以采用一些輔助技術，如藍/白斑點法和X-gal染色法，以提高篩選的靈敏度和特異性。

酵母雙雜交技術是一種常用的蛋白質互作篩選方法，可以從大量的蛋白質庫中篩選出與已知蛋白質相互作用的候選分子。在進行這項技術時，需要注意一些注意事項，并嚴格按照實驗流程進行操作。