針對(duì)胞內(nèi)靶點(diǎn)（如轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子）的流式抗體，與表面標(biāo)志物抗體相比，在樣本制備（如固定、破膜）環(huán)節(jié)有哪些特殊要求？
日期：2025-09-30 09:44:10
針對(duì)胞內(nèi)靶點(diǎn)（轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子等）的流式抗體，與表面標(biāo)志物抗體的核心差異在于需突破細(xì)胞膜屏障以實(shí)現(xiàn)抗體與胞內(nèi)抗原的結(jié)合，因此樣本制備中“固定”和“破膜”環(huán)節(jié)的操作邏輯、試劑選擇、條件控制均有特殊要求，具體差異及關(guān)鍵要點(diǎn)如下：
一、固定環(huán)節(jié)：需兼顧“抗原保留”與“后續(xù)破膜兼容性”，避免抗原變性或細(xì)胞崩解
表面標(biāo)志物抗體檢測(cè)無(wú)需固定（或僅需短時(shí)間輕固定以維持細(xì)胞形態(tài)），因表面抗原暴露于細(xì)胞膜外，抗體可直接結(jié)合；而胞內(nèi)靶點(diǎn)檢測(cè)的固定需同時(shí)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)目標(biāo)——維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性（防止胞內(nèi)成分泄漏）和保留胞內(nèi)抗原的天然構(gòu)象（確保抗體識(shí)別位點(diǎn)不被破壞），操作要求更嚴(yán)苛：
1、固定劑選擇：優(yōu)先用醛類固定劑，避免醇類對(duì)胞內(nèi)抗原的破壞
主流固定劑為4%多聚甲醛（PFA），其通過(guò)交聯(lián)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，既能固定細(xì)胞膜、防止胞內(nèi)靶點(diǎn)流失，又能最大程度保留抗原構(gòu)象（尤其適用于轉(zhuǎn)錄因子等構(gòu)象敏感型靶點(diǎn)）。需避免使用甲醇、乙醇等醇類固定劑——這類試劑會(huì)使蛋白質(zhì)變性、收縮，可能破壞胞內(nèi)抗原的抗體結(jié)合位點(diǎn)（如細(xì)胞因子的線性表位可能被折疊掩蓋），導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)大幅降低甚至假陰性。
2、固定時(shí)間與溫度：嚴(yán)格控制以平衡固定效果與抗原活性
固定時(shí)間需根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整（如懸浮細(xì)胞通常15-20分鐘，貼壁細(xì)胞需20-30分鐘），且需在室溫（20-25℃）下進(jìn)行——低溫會(huì)減緩固定反應(yīng)，導(dǎo)致固定不充分（細(xì)胞易在后續(xù)破膜時(shí)崩解）；高溫則可能加速抗原變性（如轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域易受熱破壞）。固定后需用含BSA的PBS充分洗滌（2-3次），徹底去除殘留固定劑，避免其與后續(xù)破膜劑反應(yīng)、影響胞內(nèi)環(huán)境。
二、破膜環(huán)節(jié)：需“精準(zhǔn)穿孔”以允許抗體進(jìn)入，同時(shí)避免細(xì)胞過(guò)度裂解
表面標(biāo)志物檢測(cè)無(wú)需破膜，而胞內(nèi)靶點(diǎn)檢測(cè)的破膜是核心步驟——需在細(xì)胞膜上形成孔徑足夠大（通常10-100nm）的通道，讓抗體（分子量約150kDa）進(jìn)入胞內(nèi)，同時(shí)需避免細(xì)胞完全裂解（否則細(xì)胞形態(tài)丟失、無(wú)法通過(guò)流式細(xì)胞儀分選或計(jì)數(shù)），具體要求如下：
1、破膜劑類型：根據(jù)靶點(diǎn)溶解性選擇，兼顧“穿孔效率”與“抗原保護(hù)”
破膜劑主要分為離子型去污劑（如皂素、TritonX-100）和非離子型去污劑（如NP-40），選擇需結(jié)合胞內(nèi)靶點(diǎn)的存在位置：
若檢測(cè)核內(nèi)靶點(diǎn)（如轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、p53），需選擇“核膜穿透性強(qiáng)”的破膜劑（如0.1%-0.5%TritonX-100），其不僅能破壞細(xì)胞膜，還能溶解核膜的脂質(zhì)雙層，讓抗體進(jìn)入細(xì)胞核；但需注意TritonX-100濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架破壞、細(xì)胞形態(tài)皺縮，需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳濃度（通常從0.1%開(kāi)始梯度測(cè)試）。
若檢測(cè)胞質(zhì)內(nèi)靶點(diǎn)（如細(xì)胞因子IL-2、TNF-α），選擇“溫和型”破膜劑（如0.1%皂素）即可——皂素通過(guò)與細(xì)胞膜膽固醇結(jié)合形成臨時(shí)通道，僅破壞細(xì)胞膜而不影響核膜，既能讓抗體進(jìn)入胞質(zhì)，又能保留細(xì)胞核結(jié)構(gòu)（便于后續(xù)同時(shí)檢測(cè)核內(nèi)靶點(diǎn)）；且皂素的作用可逆（去除后通道關(guān)閉），可減少對(duì)胞內(nèi)抗原的損傷。
2、破膜時(shí)間與緩沖液：需配合固定步驟，避免抗原流失
破膜需在固定后進(jìn)行（固定后的細(xì)胞結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，可減少破膜時(shí)胞內(nèi)成分泄漏），且破膜緩沖液需含“蛋白保護(hù)劑”（如1%-2%BSA、0.02%疊氮鈉）——BSA可封閉破膜后暴露的細(xì)胞內(nèi)非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少抗體非特異性吸附；疊氮鈉可抑制蛋白酶活性，防止胞內(nèi)靶點(diǎn)被降解（尤其細(xì)胞因子等易被蛋白酶水解的蛋白）。破膜時(shí)間通常為10-15分鐘（室溫），過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞碎片增多，過(guò)短則穿孔不充分、抗體無(wú)法進(jìn)入胞內(nèi)，需通過(guò)流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞散射光（FSC/SSC）確認(rèn)：若SSC（側(cè)向散射光）過(guò)高，說(shuō)明細(xì)胞裂解過(guò)度，需縮短時(shí)間或降低破膜劑濃度。
三、其他特殊要求：避免“交叉干擾”與“信號(hào)抑制”，保障檢測(cè)特異性
除固定和破膜外，胞內(nèi)流式抗體檢測(cè)的樣本制備還需關(guān)注兩個(gè)細(xì)節(jié)，這是表面標(biāo)志物檢測(cè)中無(wú)需重點(diǎn)考慮的：
1、表面標(biāo)志物與胞內(nèi)靶點(diǎn)檢測(cè)的順序：先染表面標(biāo)志物，后做固定破膜
若需同時(shí)檢測(cè)表面標(biāo)志物和胞內(nèi)靶點(diǎn)，需先進(jìn)行表面標(biāo)志物染色（抗體直接結(jié)合細(xì)胞膜外抗原），再進(jìn)行固定和破膜——固定會(huì)使表面抗原構(gòu)象改變，若先固定再染表面標(biāo)志物，可能導(dǎo)致表面抗體無(wú)法結(jié)合；且破膜劑會(huì)破壞細(xì)胞膜，若先破膜再染表面標(biāo)志物，表面抗原會(huì)隨胞內(nèi)成分一起泄漏，導(dǎo)致信號(hào)丟失。
2、抗體選擇：需確認(rèn)抗體“兼容固定破膜流程”
部分胞內(nèi)抗體僅適用于特定固定破膜體系（如僅兼容PFA-皂素體系，不兼容PFA-TritonX-100體系），因不同破膜劑可能破壞抗體的結(jié)合表位——例如某轉(zhuǎn)錄因子抗體的識(shí)別表位為“線性表位”，TritonX-100的強(qiáng)去污作用可能導(dǎo)致該表位折疊，使抗體無(wú)法結(jié)合；因此實(shí)驗(yàn)前需查閱抗體說(shuō)明書，確認(rèn)其推薦的固定破膜方案，避免因試劑不兼容導(dǎo)致檢測(cè)失敗。
胞內(nèi)靶點(diǎn)流式抗體的樣本制備，核心是通過(guò)“溫和固定保留抗原構(gòu)象+精準(zhǔn)破膜允許抗體進(jìn)入”，同時(shí)控制固定破膜的試劑類型、時(shí)間、濃度，避免對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和抗原活性的破壞——這與表面標(biāo)志物檢測(cè)“直接結(jié)合、無(wú)需突破膜屏障”的邏輯完全不同，也是胞內(nèi)流式檢測(cè)結(jié)果可靠性的關(guān)鍵所在。
