單克隆抗體制備過程,若免疫后動物未產生有效抗體,可能的原因(如抗原免疫原性弱、免疫方案不當)有哪些,該如何調整實驗方案?
日期:2025-09-28 09:22:59
在單克隆抗體制備中,免疫后動物未產生有效抗體(通常以血清效價低或無特異性結合為判斷標準)是常見問題,核心原因可歸結為抗原本身特性、免疫方案設計、動物個體差異三大類,需針對性分析并調整實驗方案。
一、核心原因分析
1.抗原相關因素(最主要原因)
抗原的免疫原性直接決定動物免疫系統能否被有效激活,是產生抗體的基礎。
(1)免疫原性極弱:
小分子抗原(如分子量<1kDa的多肽、激素、藥物)、高度保守的自身抗原(如人體同源性>95%的蛋白)或結構簡單的抗原(如單糖、脂類),因缺乏足夠的“異物信號”和免疫識別表位,難以被動物B細胞識別和呈遞。
例如:純化的人源白蛋白免疫小鼠時,因小鼠與人類白蛋白同源性高,常難以產生高滴度抗體。
(2)抗原純度不足或結構破壞:
抗原中混有大量雜蛋白(如原核表達的包涵體未徹底純化)、內毒素或降解片段,會分散免疫系統的應答焦點,導致針對目標抗原的特異性抗體減少;若抗原在純化/儲存中發生變性(如高溫、反復凍融破壞空間構象),則其天然表位消失,無法誘導特異性免疫。
(3)抗原劑量失衡:
劑量過低時,不足以激活免疫系統;劑量過高(尤其是可溶性抗原)可能誘導免疫耐受——免疫系統將高濃度抗原識別為“自身成分”,反而抑制B細胞活化(如過量的重組細胞因子免疫動物)。
2.免疫方案設計缺陷
即使抗原免疫原性尚可,不合理的免疫流程也會導致應答失敗。
(1)免疫途徑不當:
不同途徑的抗原遞呈效率差異極大。例如,僅采用腹腔注射可溶性抗原時,抗原易被快速清除,難以有效激活樹突狀細胞(DC)和T細胞;而皮內注射(含佐劑)可通過刺激局部淋巴結,顯著提升免疫應答。
(2)佐劑選擇或使用錯誤:
佐劑的核心作用是延長抗原滯留時間、激活固有免疫細胞(如巨噬細胞),增強抗原免疫原性。若未使用佐劑(尤其針對可溶性抗原)、佐劑種類不當(如用弗氏不完全佐劑做首次免疫,缺乏免疫激活成分),或佐劑與抗原混合不均(如乳化不徹底,抗原快速釋放),都會導致免疫應答微弱。
(3)免疫間隔與次數不合理:
免疫間隔過短(如<7天),動物免疫系統尚未完成B細胞增殖分化,無法產生有效記憶細胞;間隔過長(如>30天),初次免疫的記憶細胞衰減,難以疊加應答;免疫次數不足(如僅1-2次),則無法達到抗體效價峰值。
(4)抗原與佐劑比例失衡:
抗原過多而佐劑不足,無法有效“包裹”抗原;佐劑過多而抗原不足,可能引發過度炎癥反應,反而抑制特異性免疫。
3.動物個體與生理狀態影響
(1)品系不匹配:
不同近交系小鼠的MHC(主要組織相容性復合體)基因型不同,對同一抗原的識別能力差異極大。例如,C57BL/6小鼠對某些病毒抗原應答強,而BALB/c小鼠對細菌抗原應答更優,選錯品系可能導致無應答。
(2)年齡與健康狀態:
幼年動物(<6周齡)免疫系統未成熟,老年動物(>8月齡)免疫功能衰退,均難以產生強應答;動物若感染病原體(如小鼠肝炎病毒)、存在免疫缺陷(如SCID小鼠)或應激狀態(如飼養環境惡劣),也會抑制免疫反應。
(3)性別差異:
雌性動物(尤其是未孕狀態)的體液免疫應答通常強于雄性,部分抗原(如性激素相關抗原)可能因性別差異導致應答不同。

二、實驗方案調整策略
1.針對“抗原問題”的核心調整
(1)增強抗原免疫原性(最關鍵):
小分子/弱免疫原性抗原:采用“載體偶聯法”,將抗原與強免疫原性載體(如KLH、BSA、OVA)交聯(通過EDC、戊二醛等交聯劑),利用載體的表位激活T細胞,間接輔助B細胞活化。例如,多肽抗原需優先偶聯KLH后再免疫。
自身抗原:①選擇與目標物種親緣關系較遠的動物(如人源抗原免疫大鼠而非小鼠);②對自身抗原進行修飾(如磷酸化、甲基化)或截取非保守片段,打破免疫耐受;③采用“異種同源抗原聯合免疫”(如人+猴同源抗原混合免疫)。
變性抗原:重新制備/純化抗原,確保其天然構象(如采用哺乳動物細胞表達系統替代原核系統,避免包涵體變性;儲存時采用-80℃分裝凍存,避免反復凍融)。
(2)優化抗原純度與劑量:
純度:通過層析(如Ni柱、凝膠過濾)、電泳純化等方法,將抗原純度提升至>90%,去除雜蛋白和內毒素(內毒素含量需<0.1EU/μg)。
劑量:根據抗原類型調整,可溶性抗原通常首次免疫劑量為50-100μg/只(小鼠),加強免疫為25-50μg/只;顆粒性抗原(如病毒、細胞)劑量可減半(25-50μg/只),避免免疫耐受。
2.針對“免疫方案”的系統優化
(1)調整免疫途徑:
優先選擇“皮內多點注射”(背部或腹部,4-6點)或“淋巴結周圍注射”(如小鼠腋窩、腹股溝淋巴結附近),利用局部淋巴結的抗原遞呈優勢;首次免疫可結合“腹腔注射”,加強免疫采用“皮下+腹腔聯合注射”,提升應答效率。
(2)優化佐劑選擇與使用:
首次免疫:必須使用弗氏完全佐劑(CFA),其含分枝桿菌成分,可強效激活巨噬細胞和DC細胞;加強免疫改用弗氏不完全佐劑(IFA),避免CFA的過度炎癥反應。
替代佐劑:若對CFA的刺激性敏感,可選用鋁佐劑(適用于蛋白抗原)、ISCOM(免疫刺激復合物,適用于膜蛋白)或商品化佐劑(如Sigma的MPL+TDM佐劑),需提前預實驗驗證效果。
乳化要求:抗原與佐劑按1:1體積比混合,采用雙注射器反復推注至“水滴法不擴散”(滴入水中呈球形不分散),確保抗原緩慢釋放。
(3)修正免疫間隔與次數:
標準流程:首次免疫后,間隔14天進行第一次加強免疫,再間隔14天進行第二次加強免疫;加強免疫后7-10天采血檢測血清效價,若效價低,可追加1次加強免疫(間隔7天),避免過度免疫。
3.針對“動物因素”的調整
(1)更換動物品系:
若原品系(如BALB/c)無應答,可換用免疫應答更強的品系(如C57BL/6、ICR小鼠,或大鼠),優先選擇近交系動物(遺傳背景均一,應答穩定)。
(2)選擇適齡健康動物:
選用6-8周齡、體重18-22g的雌性小鼠(體液免疫應答強),確保動物無病原體感染(SPF級最佳),飼養環境穩定(溫度22-25℃、濕度40%-60%,避免應激)。
(3)預免疫篩選:
對同一批動物先進行“預免疫”(小劑量抗原+佐劑),14天后采血檢測血清效價,篩選出應答陽性的動物進行正式免疫,排除個體無應答情況。
三、關鍵驗證步驟
在調整方案后,需通過血清效價檢測(如ELISA)和特異性驗證(如WB、IHC)確認免疫效果:
若ELISA效價>1:10000,且WB/IHC顯示特異性結合,說明免疫成功;
若效價仍低但有特異性,可追加1次加強免疫;
若效價為0或無特異性,需重新排查抗原免疫原性(如更換載體偶聯方式)或徹底更換抗原/動物品系。
免疫無應答的核心是“抗原-免疫方案-動物”的匹配問題,需優先排查抗原免疫原性,再系統優化免疫流程,最終通過預實驗和效價檢測確保免疫成功。






