流式抗體的克隆號對實驗結果影響多大?若同一靶點有多個克隆號的抗體可選,該從哪些方面對比篩選?
日期:2025-09-26 14:29:32
流式抗體的克隆號是決定實驗結果特異性、準確性和重復性的核心因素之一,其對實驗結果的影響遠超“同一靶點”這一前提——即使針對相同抗原,不同克隆號的抗體可能因識別表位、親和力、交叉反應性的差異,導致檢測信號完全不同(如假陽性、假陰性或信號強度偏差),甚至直接影響實驗結論的可靠性。而同一靶點多克隆號抗體的篩選,需圍繞“實驗需求與抗體特性的匹配度”展開,具體分析如下:
一、流式抗體克隆號對實驗結果的核心影響
流式細胞術的核心是“抗體與細胞表面/胞內抗原的特異性結合”,克隆號的差異本質是抗體“識別能力”的差異,具體影響體現在4個關鍵維度:
1.識別表位的差異:決定“能否檢測到目標抗原”
每個克隆號的抗體僅識別抗原上的特定表位(線性表位或構象表位),若表位存在以下情況,不同克隆號的檢測結果會截然不同:
表位被修飾或遮蔽:例如目標抗原(如CD45)在不同細胞狀態(如活化/靜息)下存在糖基化修飾,克隆號A識別的表位被糖鏈遮蔽,而克隆號B識別的表位不受修飾影響——此時用克隆號A檢測活化細胞會出現“假陰性”,克隆號B則能正常檢出;
表位的物種/亞型特異性:例如針對小鼠CD3的克隆號“145-2C11”僅識別小鼠CD3,無法識別大鼠或人CD3;而克隆號“OKT3”僅識別人CD3——若選錯克隆號,會直接導致“無信號”;
表位位于抗原的不同結構域:例如針對細胞因子受體(如IL-6R)的抗體,克隆號C識別“配體結合域”,克隆號D識別“胞外非功能域”——若實驗目的是檢測“功能性IL-6R”(結合配體的受體),克隆號D可能檢測到所有IL-6R(包括無功能的截短體),導致結果偏差。
2.親和力的差異:決定“檢測信號的強弱與靈敏度”
親和力指抗體與抗原的結合能力,不同克隆號的親和力差異(通常用解離常數Kd表示,Kd越小親和力越高)會直接影響信號強度:
高親和力克隆號(如Kd<10??M):即使細胞表面抗原表達量低(如少量表達的干細胞標志物),也能穩定結合并產生強信號,適合“低表達抗原檢測”(如稀有細胞亞群分析);
低親和力克隆號(如Kd>10??M):僅能結合高表達抗原,低表達抗原可能因結合不牢固被洗滌步驟洗脫,導致“信號弱或假陰性”——例如檢測T細胞表面低表達的CD28,低親和力克隆號可能無法檢出,而高親和力克隆號可清晰區分陽性細胞。
3.交叉反應性的差異:決定“結果的特異性(是否假陽性)”
交叉反應指抗體與非目標抗原(結構類似的蛋白)結合的能力,不同克隆號的交叉反應性差異極大:
無交叉反應的克隆號:僅結合目標抗原,結果特異性高(如針對人CD4的克隆號“SK3”,僅識別人CD4,不與CD8或其他T細胞標志物交叉結合);
有交叉反應的克隆號:可能與其他抗原結合,導致假陽性——例如某克隆號的“抗小鼠CD11b”抗體,同時與小鼠CD11c交叉結合,若用于“CD11b?單核細胞”分選,會混入CD11c?樹突狀細胞,導致細胞純度偏低。
4.熒光素偶聯效率與穩定性的差異:影響“信號的重復性”
即使克隆號的抗原識別能力一致,不同廠家的偶聯工藝(熒光素與抗體的結合比例、偶聯穩定性)也可能不同,但克隆號本身的“結構特性”(如抗體亞型、Fc段穩定性)會影響偶聯效率:
例如克隆號E為IgG1亞型,適合與FITC、PE偶聯,偶聯后熒光素不易脫落;克隆號F為IgM亞型,偶聯PE時易出現“熒光淬滅”,導致不同批次實驗的信號波動大——這種差異會影響實驗的重復性,尤其對“定量分析”(如抗原表達量的相對比較)影響顯著。

二、同一靶點多克隆號抗體的篩選維度
篩選的核心邏輯是“讓抗體特性匹配實驗需求”,需從“實驗設計目標”反向推導,重點對比以下6個維度:
1.明確“實驗核心需求”:先定篩選方向
篩選前需先明確3個關鍵問題,避免無意義對比:
檢測物種:是小鼠、大鼠、人還是其他物種?(優先選擇“物種特異性明確”的克隆號,如說明書標注“僅適用于人”);
抗原表達狀態:目標抗原是細胞表面抗原還是胞內抗原?是否存在修飾(如磷酸化、糖基化)?(胞內抗原需選擇“可穿透細胞膜”的抗體,修飾敏感抗原需選擇“表位不受修飾影響”的克隆號);
實驗目的:是“定性檢測”(如判斷細胞是否陽性)、“定量分析”(如比較抗原表達量高低)還是“細胞分選”(如獲取高純度陽性細胞)?(定量分析需高親和力克隆號,分選需無交叉反應的克隆號)。
2.對比“表位信息”:確保能識別目標抗原
表位是篩選的“第一優先級”,需從說明書或廠家技術支持獲取以下信息:
表位類型:是線性表位(氨基酸序列明確,如“CD45的aa100-120”)還是構象表位(依賴抗原空間結構,如“CD28的extracellularloop構象”)?——若樣本經過固定(如多色流式的甲醛固定),構象表位可能被破壞,需選擇識別線性表位的克隆號;
表位是否與功能相關:例如實驗需檢測“有活性的EGFR”(磷酸化EGFR),需選擇識別“磷酸化位點表位”的克隆號(如“44-785G”識別EGFRpY1068),而非識別“總EGFR”的克隆號(如“LA1”);
表位的物種交叉性:若后續可能開展跨物種實驗(如同時檢測小鼠和人樣本),優先選擇“跨物種識別”的克隆號(如針對CD9的克隆號“HI9a”可識別人、小鼠、大鼠CD9)。
3.評估“親和力與靈敏度”:匹配抗原表達水平
根據目標抗原的表達量選擇對應親和力的克隆號:
低表達抗原(如干細胞標志物CD34、稀有免疫細胞的表面受體):優先選擇高親和力克隆號(說明書通常標注“高靈敏度”或Kd<10??M),例如檢測骨髓中CD34?細胞,克隆號“581”(高親和力)比克隆號“AC136”(中親和力)的信號更強,陽性細胞比例更準確;
高表達抗原(如T細胞表面CD3、CD4):中低親和力克隆號即可滿足需求,但需注意“信號飽和”問題——過高親和力的克隆號可能導致信號過強,影響多色流式中其他弱信號通道的補償調節。
4.核查“交叉反應性”:避免假陽性
交叉反應是導致假陽性的主要原因,需重點關注:
廠家說明書標注的“交叉反應信息”:優先選擇“無已知交叉反應”的克隆號,若說明書標注“可能與XX抗原交叉反應”(如“抗小鼠CD11b克隆號A可能與CD11c交叉”),需確認實驗樣本中是否存在該交叉抗原(如樣本中是否有CD11c?細胞),若存在則排除該克隆號;
參考已發表文獻:查看同領域研究中該克隆號的應用情況,若多篇文獻提及“無交叉反應”或“特異性高”,則優先選擇;若有文獻報道“存在假陽性”,則需謹慎。
5.匹配“熒光素與實驗方案”:確保信號穩定可檢測
熒光素的選擇需結合克隆號的偶聯兼容性和實驗通道設計:
偶聯效率:優先選擇廠家“常規偶聯”的克隆號(如某克隆號常與PE、APC偶聯,偶聯效率高且穩定),避免選擇“定制偶聯”的克隆號(可能存在偶聯不均、熒光淬滅問題);
通道匹配:根據流式細胞儀的激光和濾光片配置選擇熒光素,例如若儀器僅有488nm激光(可檢測FITC、PE),則需選擇偶聯FITC/PE的克隆號,而非APC(需633nm激光);
多色實驗的補償:若開展多色流式(如同時檢測CD4-PE、CD8-FITC),需避免選擇“熒光素發射光譜重疊嚴重”的克隆號組合(如CD4-PE和CD45-PE-Cy7,重疊較少;而CD4-PE和CD8-PE,重疊嚴重,無法區分)。
6.參考“應用數據與口碑”:降低實驗風險
廠家提供的“應用驗證數據”:優先選擇有明確流式驗證數據的克隆號(如說明書附帶“人外周血CD4?T細胞檢測的流式圖”,顯示陽性細胞群清晰、背景低);
文獻引用量與用戶評價:在PubMed或ResearchGate中檢索該克隆號的引用情況,引用量高、同領域研究者推薦的克隆號(如“抗人CD3克隆號OKT3”“抗小鼠CD4克隆號GK1.5”)通常更可靠;
預實驗驗證:若條件允許,對2-3個候選克隆號進行小規模預實驗,對比其陽性細胞比例、信號強度、背景噪音(如陰性對照的熒光強度),選擇“信號強、背景低、結果與預期一致”的克隆號。
流式抗體的克隆號直接決定實驗“能否成功”,而非“影響大小”的問題——選錯克隆號可能導致實驗完全失敗。同一靶點篩選時,需先明確實驗需求(物種、抗原狀態、實驗目的),再按“表位匹配→親和力匹配→交叉反應排除→熒光素匹配→應用驗證”的邏輯層層篩選,最終選擇“特性與需求完全契合”的克隆號,而非單純依賴“知名度”或“價格”。






