怎么判斷流式抗體是否適用于特定樣本類型（如外周血單個(gè)核細(xì)胞、組織單細(xì)胞懸液、培養(yǎng)細(xì)胞），是否需要提前進(jìn)行樣本兼容性測(cè)試？

日期：2025-09-17 14:20:10

判斷流式抗體是否適用于特定樣本類型（如外周血單個(gè)核細(xì)胞 PBMC、組織單細(xì)胞懸液、培養(yǎng)細(xì)胞），需從抗體本身的特性參數(shù)、樣本的生物學(xué)特征兩方面綜合評(píng)估，而樣本兼容性測(cè)試是驗(yàn)證適用性的關(guān)鍵步驟，無法完全通過理論判斷替代。以下是具體判斷邏輯和操作方法：

一、核心判斷依據(jù)：從抗體特性匹配樣本類型

流式抗體的說明書（或供應(yīng)商提供的技術(shù)文檔）是最直接的判斷依據(jù)，需重點(diǎn)關(guān)注以下6個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，逐一匹配目標(biāo)樣本的特性：

關(guān)鍵參數(shù)	與樣本類型的匹配邏輯	示例（錯(cuò)誤匹配場(chǎng)景）
1.特異性識(shí)別的抗原表位	確認(rèn)抗體針對(duì)的抗原在目標(biāo)樣本中是否表達(dá)、且表位是否未被樣本處理破壞。	用識(shí)別“細(xì)胞內(nèi)抗原（如轉(zhuǎn)錄因子Foxp3）”的抗體檢測(cè)未固定破膜的活細(xì)胞（表位被細(xì)胞膜遮蔽，無法結(jié)合）；用識(shí)別“膜表面糖基化修飾表位”的抗體檢測(cè)經(jīng)高濃度蛋白酶（如胰酶）消化的組織單細(xì)胞懸液（表位被酶解，信號(hào)消失）。
2.樣本種屬匹配	抗體說明書會(huì)明確標(biāo)注“適用種屬”（如Human/Mouse/Rat），需與樣本來源種屬完全一致。	用“小鼠CD4抗體”檢測(cè)人PBMC（無交叉反應(yīng)，無信號(hào)）；部分抗體標(biāo)注“交叉反應(yīng)種屬”（如Anti-HumanCD3cross-reactswithMonkey），需確認(rèn)是否覆蓋目標(biāo)樣本種屬。
3.抗體克隆號(hào)	同一抗原的不同克隆號(hào)，可能因表位親和力、組織/細(xì)胞特異性差異，適用于不同樣本。	克隆號(hào)OKT3的抗人CD3抗體，對(duì)PBMC中T細(xì)胞識(shí)別效率高，但對(duì)組織單細(xì)胞懸液中活化T細(xì)胞的識(shí)別可能弱于克隆號(hào)UCHT1；部分克隆號(hào)（如抗小鼠CD45的30-F11）對(duì)造血細(xì)胞特異性高，不識(shí)別非造血來源的培養(yǎng)細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞）。
4.抗體形式（偶聯(lián)/未偶聯(lián)）	未偶聯(lián)抗體（需二抗檢測(cè)）需確認(rèn)二抗的種屬來源與樣本無交叉（避免非特異性結(jié)合）；偶聯(lián)抗體需確認(rèn)熒光素在樣本處理中是否穩(wěn)定。	用“兔抗人CD20未偶聯(lián)抗體”檢測(cè)兔來源的組織單細(xì)胞懸液，再用熒光二抗（抗兔IgG）檢測(cè)時(shí)，二抗會(huì)結(jié)合樣本中兔自身IgG，導(dǎo)致非特異性熒光。
5.推薦的樣本處理方案	說明書會(huì)標(biāo)注“推薦樣本類型”（如“適用于PBMC、培養(yǎng)細(xì)胞”）及配套的處理步驟（如是否需固定、破膜、酶解）。	說明書標(biāo)注“適用于活細(xì)胞表面染色”的抗體，用于經(jīng)4%多聚甲醛固定的組織單細(xì)胞懸液（固定可能導(dǎo)致抗原構(gòu)象改變，抗體無法結(jié)合）。
6.參考文獻(xiàn)/應(yīng)用案例	優(yōu)先選擇有“目標(biāo)樣本應(yīng)用案例”的抗體（如供應(yīng)商官網(wǎng)標(biāo)注“已驗(yàn)證用于人肺癌組織單細(xì)胞懸液的CD44檢測(cè)”），減少試錯(cuò)成本。	若抗體僅標(biāo)注“適用于培養(yǎng)細(xì)胞”，無組織樣本案例，直接用于腫瘤組織單細(xì)胞懸液時(shí)，可能因組織中雜質(zhì)（如膠原、壞死細(xì)胞碎片）干擾，導(dǎo)致信噪比降低。

二、不同樣本類型的特殊適配要求

除通用參數(shù)外，PBMC、組織單細(xì)胞懸液、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性差異較大，需針對(duì)性關(guān)注以下要點(diǎn)：

1. 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）

核心關(guān)注點(diǎn)：抗原是否為造血細(xì)胞特異性、避免紅細(xì)胞 / 血小板干擾。

優(yōu)先選擇 “造血細(xì)胞表面抗原抗體”（如 CD3/CD4/CD8/CD19 等），這類抗體對(duì) PBMC 的特異性通常已驗(yàn)證；

若檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原（如細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子），需確認(rèn)抗體適配 “PBMC 固定破膜方案”（如用 BD Cytofix/Cytoperm 試劑盒處理后，抗體是否仍能結(jié)合表位）；

避免使用 “易與紅細(xì)胞結(jié)合的抗體”（如抗 CD235a，僅用于紅細(xì)胞染色），防止殘留紅細(xì)胞干擾信號(hào)。

2. 組織單細(xì)胞懸液

核心關(guān)注點(diǎn)：抗原是否耐受組織消化過程、是否存在組織特異性干擾。

組織需經(jīng)酶解（如膠原酶、透明質(zhì)酸酶）或機(jī)械研磨制備單細(xì)胞懸液，需確認(rèn)抗體針對(duì)的表位不被消化酶破壞（如糖蛋白類表位需避免長時(shí)間胰酶消化）；

部分組織（如肝臟、腎臟）含大量非靶細(xì)胞（如肝細(xì)胞、腎小管細(xì)胞）或細(xì)胞碎片，需選擇 “靶細(xì)胞特異性高的抗體”（如檢測(cè)腫瘤組織中的 T 細(xì)胞，優(yōu)先用 CD3+CD45RO + 等組合標(biāo)記，減少基質(zhì)細(xì)胞干擾）；

脂肪組織、纖維組織等易產(chǎn)生粘性雜質(zhì)，需確認(rèn)抗體是否會(huì)與雜質(zhì)非特異性結(jié)合（可通過 “空白對(duì)照” 觀察）。

3. 培養(yǎng)細(xì)胞（如貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞）

核心關(guān)注點(diǎn)：細(xì)胞狀態(tài)對(duì)表位表達(dá)的影響、是否存在培養(yǎng)基成分干擾。

貼壁細(xì)胞需經(jīng)胰酶 / EDTA 消化后制成單細(xì)胞懸液，需確認(rèn)抗體表位不被消化試劑破壞（如 EDTA 濃度過高可能影響鈣依賴的膜蛋白表位）；

部分培養(yǎng)細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞系）可能因傳代次數(shù)過多、培養(yǎng)條件（如缺氧、營養(yǎng)缺乏）改變，導(dǎo)致抗原表達(dá)量下降，需選擇 “高親和力克隆號(hào)的抗體”（如抗人 EGFR 的克隆號(hào) C225，對(duì)低表達(dá) EGFR 的培養(yǎng)細(xì)胞仍有良好信號(hào)）；

培養(yǎng)基中的血清成分（如牛 IgG）可能與抗體交叉反應(yīng)，需用 “無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后染色”，或選擇 “不與牛 IgG 交叉的抗體”（如山羊來源的一抗，二抗選擇抗山羊 IgG）。

三、必須進(jìn)行的樣本兼容性測(cè)試：理論判斷無法替代

即使抗體參數(shù)與樣本類型 “理論匹配”，仍需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試驗(yàn)證兼容性，避免因樣本個(gè)體差異、處理過程波動(dòng)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。測(cè)試方案需包含以下 3 個(gè)核心對(duì)照和 1 個(gè)信號(hào)驗(yàn)證步驟：

1. 設(shè)置關(guān)鍵對(duì)照，排除非特異性干擾

對(duì)照類型目的操作方法

對(duì)照類型	目的	操作方法
空白對(duì)照（Unstained Control）	確認(rèn)樣本自身的自發(fā)熒光強(qiáng)度，避免將自發(fā)熒光誤判為特異性信號(hào)。	取未加任何抗體的目標(biāo)樣本，按相同染色步驟處理后上流式儀檢測(cè)。
同型對(duì)照（Isotype Control）	確認(rèn)抗體的非特異性結(jié)合（如抗體 Fc 段與樣本細(xì)胞表面 Fc 受體結(jié)合）。	選擇與待檢抗體 “種屬、亞型、偶聯(lián)熒光素完全一致” 的無關(guān)抗體（如待檢抗體為 Mouse IgG1-PE 抗 CD4，同型對(duì)照為 Mouse IgG1-PE 無關(guān)抗體），按相同濃度染色。
陽性對(duì)照（Positive Control）	確認(rèn)抗體能正常結(jié)合陽性細(xì)胞，排除抗體失效或操作錯(cuò)誤。	若檢測(cè)人 CD3，可用已知 CD3 + 的 PBMC 作為陽性對(duì)照；若檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的抗原，可用已知高表達(dá)該抗原的細(xì)胞系（如檢測(cè) HeLa 細(xì)胞的 EGFR，可用 A431 細(xì)胞（高表達(dá) EGFR）作為陽性對(duì)照）。