流式抗體用于分選實驗時，與僅用于分析的抗體相比，在純度、活性和熒光素穩定性上是否有更高要求？
日期：2025-09-12 13:45:47
流式抗體用于分選實驗（如流式細胞分選，FACS）時，與僅用于分析的抗體相比，在純度、活性和熒光素穩定性上確實有更高要求，這與分選實驗的核心目標（獲得活的、高純度的目標細胞群，且不影響后續功能研究）直接相關。具體差異如下：
一、純度要求更高
分析用抗體：主要用于識別目標細胞并通過熒光信號進行定性/定量分析，允許存在少量非特異性雜質（如未結合的熒光素、微量雜蛋白），只要不顯著干擾熒光信號的特異性即可。
分選用抗體：需與細胞表面抗原穩定結合，且殘留雜質可能直接影響分選細胞的活性或后續功能。例如：
若抗體中含有未純化的游離熒光素，可能非特異性吸附到細胞表面，導致分選時“假陽性”細胞被誤選，降低分選純度；
若存在雜蛋白（如血清成分、細胞培養污染物），可能引發細胞聚集、激活或毒性反應，影響分選后細胞的存活或功能（如后續培養、增殖、分化實驗）。
標準差異：分選用抗體通常需經過更嚴格的純化步驟（如ProteinA/G親和層析+離子交換層析），確保抗體純度＞95%，且無游離熒光素、內毒素、蛋白酶等污染物。
二、活性要求更嚴格
分析用抗體：只需能特異性結合目標抗原并產生可檢測的熒光信號即可，對結合親和力的“持續性”要求較低（分析過程通常僅需數十分鐘至1小時）。
分選用抗體：需滿足兩個核心需求：
高特異性結合：避免與非目標細胞的交叉反應，否則會導致分選細胞群中混入雜質細胞（分選純度下降）；
穩定結合能力：分選過程（尤其是大規模分選）可能耗時數小時，抗體需在孵育、洗滌、分選的全過程中保持與抗原的穩定結合，不輕易解離，否則會導致目標細胞熒光信號減弱，被誤判為陰性細胞而丟失。
額外要求：分選用抗體需對細胞毒性極低。分析用抗體即使有輕微毒性，僅影響分析結果的準確性；但分選后細胞常需用于后續培養、功能實驗（如細胞擴增、測序、移植等），若抗體本身或其偶聯物（如熒光素）具有細胞毒性，會直接導致細胞死亡或功能異常。因此，分選用抗體需經過嚴格的細胞毒性驗證（如檢測分選后細胞的存活率、增殖能力）。
三、熒光素穩定性要求更高
分析用抗體：熒光素需在流式分析的短時間內保持穩定（避免光漂白或淬滅），但對長期穩定性（如分選過程中的持續照射）要求較低。
分選用抗體：分選過程中，細胞需經過激光多次照射（用于識別熒光信號并觸發分選），且分選時間可能長達數小時，熒光素需具備更強的抗光漂白能力：
若熒光素穩定性不足，會導致目標細胞的熒光信號強度逐漸下降，分選儀器可能無法有效識別，造成目標細胞丟失或分選效率降低；
此外，分選后的細胞若需進行二次檢測（如驗證分選純度），熒光信號的穩定性也需保持，避免結果偏差。
常用熒光素差異：分選實驗更傾向于選擇穩定性更高的熒光素（如APC、PE-Cy7等），而某些易淬滅的熒光素（如FITC）在分選時需更嚴格控制光照條件，或優先選擇其穩定衍生物。
分選用流式抗體因需保障目標細胞的高純度、高活性及后續功能完整性，在純度（減少雜質干擾）、活性（特異性強且結合穩定，低毒性）、熒光素穩定性（抵抗長時間激光照射）上的要求顯著高于僅用于分析的抗體。實際應用中，需優先選擇明確標注“適合分選FACS-suitable”的抗體，并通過預實驗驗證其對分選效率和細胞活性的影響。
