重組蛋白實驗中,若目標蛋白表達量極低,除了優化表達條件,是否需要考慮基因序列的密碼子偏好性優化,優化時需注意什么?
日期:2025-09-10 15:07:22
需要考慮密碼子偏好性優化,這是提升重組蛋白表達量的關鍵策略之一,尤其當表達宿主(如大腸桿菌、CHO細胞)與目標蛋白來源物種的密碼子使用頻率差異較大時,優化可顯著減少翻譯瓶頸。
優化時需注意的核心要點
匹配宿主密碼子偏好:需基于具體表達宿主(如大腸桿菌、酵母、HEK293、CHO 細胞)的密碼子使用數據庫,優先選擇宿主中使用頻率高的 “最優密碼子”,避免連續出現宿主稀有密碼子(易導致核糖體停滯)。
避免關鍵序列元件破壞:優化過程中需避開目標蛋白的功能結構域(如活性位點、結合位點)對應的密碼子,防止因堿基替換改變氨基酸序列;同時避免引入或破壞酶切位點、啟動子、終止子、核糖體結合位點(RBS) 等調控元件。

控制GC含量均衡:避免序列中出現過高(>65%)或過低(<30%)的GC含量,防止形成復雜二級結構(如發夾結構)阻礙轉錄/翻譯,通常需將 GC 含量調整至與宿主基因組相近的范圍(如大腸桿菌約50%)。
避免重復/連續序列:避免出現長片段重復序列(如連續≥6個相同堿基)或poly (A) 尾等,防止轉錄提前終止、mRNA 降解或測序困難。
保留信號肽/標簽的功能:若目標蛋白含信號肽(如分泌表達)、融合標簽(如 His-tag),需確保這些區域的密碼子優化不影響其定位、折疊或純化功能(例如避免信號肽切割位點的密碼子改變)。
驗證優化方案:優化后建議通過生物信息學工具(如DNAman、Vector NTI)預測 mRNA二級結構、酶切位點等,排除潛在問題;條件允許時可設計2-3種不同優化方案并行測試,篩選最優表達序列。






