選擇流式抗體時,如何根據目標細胞標志物(如CD分子、細胞因子)的表達豐度,確定抗體的親和力和特異性要求?
日期:2025-09-03 10:16:08
在流式細胞術(FCM)中,目標細胞標志物的表達豐度直接決定了抗體的親和力和特異性選擇策略,核心邏輯是 “低豐度標志物需更高親和力以確保信號捕獲,高豐度標志物需更強特異性以避免背景干擾”。以下從表達豐度分類出發,結合親和力、特異性的核心要求及實踐建議展開說明:
四、實踐工具:如何快速確認抗體的親和力與特異性?
一、先明確:標志物表達豐度的分類標準
流式中 “表達豐度” 通常以單個細胞表面的分子數量(或胞內分子濃度) 劃分,需結合抗原類型(表面抗原 / 胞內抗原 / 細胞因子)和細胞狀態(靜息/活化)判斷,常見分類如下:
| 豐度類型 | 表面抗原(分子/細胞) | 胞內抗原/細胞因子 | 典型例子 |
| 高豐度 | >10,000 | 高濃度(如管家蛋白) | CD45(全白細胞)、CD3(T細胞)、CD19(B 細胞) |
| 中豐度 | 1,000-10,000 | 中等濃度 | CD4(Th 細胞)、CD8(Tc細胞)、CD28(共刺激分子) |
| 低豐度 | <1,000 | 低濃度(如少量分泌的細胞因子) | CD25(Treg 細胞,靜息時低表達)、CD127(IL-7 受體,Treg 中低表達)、IL-4/IL-17(活化 Th 細胞分泌,含量低) |

二、不同豐度標志物的抗體選擇策略
1. 低豐度標志物:優先保證 “高親和力”,特異性需 “無交叉反應”
低豐度標志物(如靜息 Treg 的 CD25、少量分泌的細胞因子 IL-2)的核心挑戰是信號弱、易被背景噪聲掩蓋,因此抗體選擇需以 “高效捕獲抗原” 為核心,同時避免非特異性結合進一步稀釋信號。
(1)親和力要求:必須選擇高親和力抗體
親和力的衡量指標:以解離常數(Kd) 為核心,Kd 值越小,親和力越高(Kd < 10?? M為高親和力,Kd 10??~10??M 為中等親和力)。
為什么關鍵?低豐度抗原與抗體結合的 “機會少”,高親和力抗體能通過更強的抗原結合能力(更低的解離速率),減少結合后 “脫靶”,確保每個抗原都能穩定結合抗體并產生熒光信號。
例:檢測靜息Treg的CD25時,若使用Kd=10??M 的中等親和力抗體,可能因結合不牢導致信號微弱、群分不開;而Kd=10?¹?M 的高親和力抗體可高效結合少量CD25,顯著提升信號峰與背景的差異(信噪比 S/N)。
(2)特異性要求:嚴格排除交叉反應,避免 “假陽性信號疊加”
低豐度標志物的信號本就弱,若抗體與其他高豐度抗原交叉反應(如抗 CD25 抗體交叉結合CD4),會導致背景信號升高,直接掩蓋目標信號。
實踐建議:選擇經流式驗證(FCM-verified) 的抗體,優先選擇 “單克隆抗體”(比多克隆抗體特異性更高,交叉反應少),并查看說明書中 “交叉反應聲明”(如是否與其他CD分子、Fc受體交叉)。

2. 高豐度標志物:優先保證 “高特異性”,親和力可適當放寬
高豐度標志物(如全白細胞的CD45、T細胞的CD3)的核心挑戰是抗體過量結合導致的 “非特異性背景干擾”(如抗體與細胞表面 Fc 受體結合、多色實驗中熒光素串色),而非信號捕獲能力。
(1)特異性要求:必須無交叉反應,優先 “亞型匹配”
核心需求:避免抗體與非目標細胞/抗原結合,尤其是多色流式中,高豐度標志物的抗體若交叉反應,會導致 “串色” 或 “假陽性群體污染”。
例:CD45是全白細胞高豐度抗原,若抗 CD45 抗體交叉結合紅細胞(無 CD45),會導致紅細胞被誤判為白細胞,干擾計數;若在CD45/CD3/CD4三色實驗中,抗CD3抗體交叉結合CD19,會導致 B 細胞被誤判為 T 細胞。
(2)實踐建議:
選擇 “針對特定亞型的單克隆抗體”:如CD45有多種亞型(CD45RA、CD45RO),需明確目標亞型,避免抗體識別非目標亞型。
避免 “Fc 受體結合”:若細胞表達FcγR(如單核細胞、巨噬細胞),需選擇 “Fc 段封閉的抗體” 或使用無關 IgG 封閉 Fc 受體,減少非特異性結合。
(3)親和力要求:中等至較高親和力即可,無需追求 “極高親和力”
高豐度抗原分子數量多,即使是中等親和力抗體(Kd=10??M)也能充分結合抗原,產生強信號;過高親和力抗體(如Kd=10?¹¹M)反而可能因 “結合過牢”,在多色實驗中增加熒光素串色風險(如抗體 - 抗原復合物不易解離,導致其他抗體結合空間受限)。
例外:若需 “快速染色”(如臨床樣本緊急檢測),可選擇高親和力抗體,縮短結合時間(通常 10-15 分鐘即可,中等親和力需20-30分鐘)。
3. 中豐度標志物:“親和力與特異性平衡”,優先 “驗證過的抗體”
中豐度標志物(如CD4、CD8)信號強度適中,無明顯短板,選擇核心是 “平衡親和力與特異性”,避免單一指標不足導致實驗誤差。
(1)親和力要求:中等至較高親和力(Kd<10?? M)
無需像低豐度那樣追求極高親和力,但需保證結合效率,避免因親和力過低導致 “部分抗原未結合”,使目標群體的熒光強度分布過寬(如CD4+ T細胞群出現 “模糊峰”)。
(2)特異性要求:無交叉反應,優先 “多應用驗證” 抗體
需確保抗體不與其他中 / 高豐度抗原交叉(如抗CD4抗體不交叉結合CD8),同時選擇經 “不同細胞類型驗證” 的抗體(如同時驗證外周血單個核細胞 PBMC、脾臟細胞中的CD4表達),避免在特定細胞群中出現假陰性。
三、額外關鍵因素:抗原類型與抗體選擇的聯動
除了表達豐度,抗原的 “存在形式”(表面/胞內/細胞因子)也會影響親和力和特異性的要求,需結合豐度綜合判斷:
| 抗原類型 | 核心挑戰 | 親和力補充要求 | 特異性補充要求 |
| 表面抗原 | Fc受體非特異性結合 | 中低豐度需高親和力,高豐度中等即可 | 封閉Fc受體,選擇Fc段突變的抗體 |
| 胞內抗原 | 固定破膜后抗原構象改變 | 需選擇 “識別變性后抗原” 的高親和力抗體 | 避免與胞內其他蛋白交叉(如核蛋白抗體不結合胞質蛋白) |
| 細胞因子 | 分泌后濃度低、易降解 | 必須高親和力(Kd<10?? M),確保捕獲少量細胞因子 | 選擇 “中和能力弱” 的抗體(避免影響細胞因子活性),無種屬交叉 |
四、實踐工具:如何快速確認抗體的親和力與特異性?
(1)查看抗體說明書:
親和力:優先選擇說明書明確標注 Kd 值的抗體(如 “Kd =5×10?¹? M”),或標注 “High Affinity” 的抗體。
特異性:查看 “Applications” 部分是否有 “FCM” 驗證,“Specificity” 部分是否聲明 “無交叉反應”,或提供 “陽性對照細胞” 的流式圖。
(2)參考 “抗體數據庫”:
常用數據庫:BioLegend Antibody Database、eBioscience Antibody Portal,可輸入標志物名稱(如CD25),篩選 “FCM 適用”“High Affinity” 的抗體,并查看其他用戶的實驗評價。
(3)預實驗驗證:
用 “陽性對照細胞”(已知高表達目標標志物)和 “陰性對照細胞”(無目標標志物)測試抗體:
親和力判斷:陽性細胞的熒光強度是否顯著高于陰性細胞(信噪比S/N>5為合格)。
特異性判斷:陰性細胞是否無熒光信號(假陽性率<1%為合格)。
確定標志物豐度(高/中/低)→ 2. 低豐度優先高親和力(Kd<10?? M),高豐度優先高特異性(無交叉)→ 3. 結合抗原類型(表面/胞內/細胞因子)補充篩選→ 4. 用說明書和預實驗驗證。






